朱婷婷 李宏俊 何雨 崔文麗 馬偉 沈悅(亳州學(xué)院，安徽 亳州 236800)

0 引言

生姜(Zingiber officinale Roscoe)又名地辛、百辣云，屬姜科姜屬多年生草本植物，藥食兩用。它既是一種調(diào)味料，也是一味常見(jiàn)的中藥材。經(jīng)典藥學(xué)著作研究表明，它具有解表散寒、溫中止嘔、化痰止咳、解魚(yú)蟹毒之功效，被譽(yù)為“嘔家圣藥”。生姜油(Ginger oil)為生姜的提取物，在醫(yī)藥行業(yè)得到了廣泛的應(yīng)用，尤其是在保健及疾病的預(yù)防和治療方面，如抗衰老、抑菌、溶栓、降血脂、抗腫瘤等[1]，有明顯的功效。

近年來(lái)，口腔疾病愈發(fā)引起醫(yī)學(xué)界的關(guān)注，口腔“炎癥”問(wèn)題為重中之重，而炎癥的有效控制在于提高機(jī)體抵抗力和降低微生物數(shù)量[2-4]，最平常的刷牙并不能完全清楚炎癥，且市面上大多數(shù)牙膏都以美白牙齒和改善口氣為主，并不能完全清楚這些炎癥。功能性的漱口水作為一種補(bǔ)充方法，具有良好的滲透性，可深入口腔各部位，包括牙刷難接觸的牙齦邊緣和牙縫間，從而起到有效的抑菌作用，改善口腔健康[3-4]

本研究以生姜油為原料，添加檸檬酸、山梨醇、木糖醇等開(kāi)發(fā)成一種新型漱口水，并具有很好的清潔口腔和抑菌作用，為其未來(lái)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供了技術(shù)支持。

1 材料

1.1 儀器

XSE104電子天平(梅特勒-托利多 METTLER TOLEDO)、超純水器(科寧特 Cleaned)、SW-CJ-1F/1FD單人單面垂直送風(fēng)凈化工作臺(tái)(蘇州凈化)、PWT-P75B恒溫培養(yǎng)箱(達(dá)斯卡特)、GR85DA滅菌容器(致微儀器有限公司)、DW-86L338J(2018)超低溫保存箱(青島海爾生物醫(yī)療股份有限公司)。

1.2 藥品與試劑

氯化十六烷基吡啶鎓(薩恩化學(xué)技術(shù)有限公司)、吐溫-20(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)、檸檬酸(AR，上海展云化工有限公司)、山梨醇(食品級(jí)，浙江一諾生物科技有限公司)、木糖醇(食品級(jí)，河南萬(wàn)邦實(shí)業(yè)有限公司)、糖精鈉(食品級(jí)，河南萬(wàn)邦實(shí)業(yè)有限公司)桂花香精(食品級(jí)，河南萬(wàn)邦實(shí)業(yè)有限公司)、慶大霉素(醫(yī)用)、生理鹽水(醫(yī)用)、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基(TSB，北京三藥科技開(kāi)發(fā)公司)、胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基(TSA，北京三藥科技開(kāi)發(fā)公司)。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)菌株

金黃色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus ATCC25923)、大腸桿菌 (Escherichia coli ATCC25922)。

2 方法

2.1 生姜漱口水的配制

精密稱(chēng)取生姜油0.25g，加吐溫2.5g，充分晃動(dòng)混勻，緩慢加入500mL 60℃的純凈水，充分?jǐn)嚢柚脸吻逋该?。再加入吡啶鎓2.5g，檸檬酸2.5g，山梨醇10g，木糖醇10g，糖精香精若干，充分?jǐn)嚢杌靹?，放?h。待溶液冷卻至室溫，取最上層250mL，灌裝、滅菌、貼標(biāo)簽，即得生姜漱口水。

2.2 生姜漱口水抗菌活性測(cè)試

2.2.1 菌種的活化及培養(yǎng)

將高壓滅菌后的液體培養(yǎng)基(10mL)注入離心管中冷卻至室溫；從-80℃的保存箱里拿出菌種放置至室溫；再在超凈工作臺(tái)上用接種環(huán)蘸取菌液放入離心管中(重復(fù)2～3次)，每種菌株做三組平行實(shí)驗(yàn)，放在37℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24h。

2.2.2 菌種的純化培養(yǎng)

用接種環(huán)蘸取2.2.1所述，培養(yǎng)24h后略微渾濁的菌液以平板劃線法在培養(yǎng)基上接種，每個(gè)菌種接種三組，結(jié)束后倒置放入恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h。用接種環(huán)挑取平板上獨(dú)立的單個(gè)菌落，放入裝有液體培養(yǎng)基的離心管中，每種菌株做三組平行實(shí)驗(yàn)，在37℃下培養(yǎng)24h。

2.2.3 細(xì)菌總菌落數(shù)的測(cè)定

分別取上述2.2.2純化后的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌菌液1mL制成不同的10倍遞增稀釋液，然后從每個(gè)稀釋液中分別取出1mL置于無(wú)菌平皿中與營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基混合，每個(gè)濃度做三組平行實(shí)驗(yàn)，結(jié)束后倒置于37℃的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h。挑選每平皿平均細(xì)菌菌落數(shù)大于30，小于300的平板計(jì)算原始菌液的濃度(CFU·mL-1)

2.2.4 菌懸液的制備

取上述已知濃度的原菌液，加生理鹽水，配置成含菌數(shù)約為0.5麥?zhǔn)蠞舛?1×108CFU·mL-1)的菌懸液，4℃下儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.5 抗菌活性測(cè)試

紙片擴(kuò)散法[5-6]用已滅菌的移液槍吸取100μL菌懸液于TSA培養(yǎng)基表面，用無(wú)菌三角涂布棒涂布均勻；分別取生姜漱口水、慶大霉素、生理鹽水各8μL滴于6mm無(wú)菌濾紙片上，充分吸收；將含漱口水的濾紙片貼到平板中，并放入含有慶大霉素的濾紙片作為陽(yáng)性對(duì)照和含有無(wú)菌生理鹽水的濾紙片作為陰性對(duì)照，每種菌株做三組平行實(shí)驗(yàn)。于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h后，采用十字交叉法量取抑菌圈直徑(mm)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以x±s表示。

2.2.6 最小抑菌濃度(MIC)的測(cè)定

采用微量肉湯稀釋法[7-9]測(cè)定。取一次性無(wú)菌96孔板，在第一排每個(gè)孔中分別加入100μL TSB培養(yǎng)基。取100μL漱口水加入到第一孔，混勻后吸取100μL加入第二孔，反復(fù)二倍稀釋至第10孔，第10孔吸取100μL棄去。再吸取1×108CFU·mL-1加入到1至11孔，充分混勻后加蓋置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。取出，用酶標(biāo)儀測(cè)其吸光度。每種菌株做三組平行實(shí)驗(yàn)。

上述1～10孔為實(shí)驗(yàn)組；第11孔只加培養(yǎng)基和菌液作為陽(yáng)性對(duì)照組，用以觀察該濃度的菌液是否生長(zhǎng)良好并用于實(shí)驗(yàn)；第12孔只加培養(yǎng)基作為陰性對(duì)照組，用以觀察培養(yǎng)基是否被污染。用酶標(biāo)儀測(cè)量實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的吸光度，并計(jì)算其MIC。

2.2.7 最低殺菌濃度(MBC)的測(cè)定

采用瓊脂培養(yǎng)基平板法[10]進(jìn)行測(cè)定。用移液槍從上述2.2.6的96孔板中未見(jiàn)細(xì)菌生長(zhǎng)的孔里吸取100μL培養(yǎng)液，接種至TSA培養(yǎng)基中，用無(wú)菌三角涂布棒涂布均勻，倒置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。每種菌株做三組平行實(shí)驗(yàn)。

3 結(jié)果與討論

3.1 細(xì)菌總菌落數(shù)

計(jì)算公式：

式中：C為某一稀釋度下平板上生長(zhǎng)的平均菌落數(shù)；V為涂布平板時(shí)所用的稀釋液體積(mL)；M為稀釋倍數(shù)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)詳見(jiàn)表1。

金黃色葡萄球菌濃度：1.02×1011CFU·mL-1；

大腸桿菌濃度：7.7×1010CFU·mL-1。

表1 細(xì)菌菌落數(shù)

3.2 抑菌圈

本實(shí)驗(yàn)以抑菌圈大小評(píng)價(jià)抑菌效果，抑菌圈越大，表示抑菌效果越好，詳見(jiàn)圖1。生姜漱口水對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均有不錯(cuò)的抑菌效果，且抑菌效果穩(wěn)定，二者抑菌圈直徑均>10mm，見(jiàn)表2。

3.3 漱口水MIC和MBC的測(cè)定

金黃色葡萄球菌96孔板的吸光度數(shù)據(jù)詳見(jiàn)圖2，大腸桿菌96孔板吸光度數(shù)據(jù)詳見(jiàn)圖3。MIC為生姜漱口水對(duì)兩個(gè)菌種的平均抑制濃度，MBC為兩菌種每平皿細(xì)菌菌落數(shù)小于5對(duì)應(yīng)的 漱口水濃度的平均數(shù)，詳見(jiàn)表3。

圖1 不同菌株抑菌圈大小結(jié)果

表2 生姜漱口水的抑菌活性(x±s,n=3)

圖2 金黃色葡萄球菌96孔板吸光度數(shù)據(jù)

圖3 大腸桿菌96孔板吸光度數(shù)據(jù)

表3 生姜漱口水的MIC和MBC測(cè)定結(jié)果(n=2)

4 結(jié)語(yǔ)

通過(guò)一系列抗菌測(cè)試，發(fā)現(xiàn)生姜漱口水對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑制作用都十分顯著，二者M(jìn)IC都為0.49mg/mL；MBC分別為1.95mg/mL和0.98mg/mL。該漱口水對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑制作用比抗生素更加溫和且安全，不僅能清潔口腔和改善異味，還可以抑制細(xì)菌滋生，是一款安全高效的功能性漱口水。本研究豐富了現(xiàn)有口腔護(hù)理產(chǎn)品的功能和種類(lèi)，同時(shí)還為生姜漱口水后續(xù)研發(fā)和生產(chǎn)提供了理論參考。