郭 冉，李蕓芊，屠鵬飛，朱枝祥

（北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 100029）

免疫是一種重要的機(jī)體防御功能，機(jī)體免疫系統(tǒng)通過(guò)清除入侵微生物、寄生蟲(chóng)和突變細(xì)胞，維持生理功能的穩(wěn)定。免疫系統(tǒng)主要由免疫細(xì)胞和免疫因子組成，根據(jù)免疫系統(tǒng)發(fā)揮免疫調(diào)控作用的方式可分為天然免疫和適應(yīng)性免疫。天然免疫主要是天然免疫細(xì)胞通過(guò)識(shí)別病原相關(guān)模式分子（pathogen-associated molecular patterns，PAMP）或損傷相關(guān)模式分子（damage-associated molec?ular patterns，DAMP），以低特異性的方式清除大部分病原和損傷細(xì)胞[1-5]。適應(yīng)性免疫是機(jī)體針對(duì)內(nèi)外源抗原，激起的特異性免疫反應(yīng)，最終通過(guò)細(xì)胞免疫或抗體介導(dǎo)的體液免疫特異清除病原體、病毒感染細(xì)胞和突變細(xì)胞，并具有免疫記憶功能[6-7]。雖然正常免疫功能對(duì)機(jī)體防御疾病發(fā)揮重要作用，但免疫功能失調(diào)也會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的疾病。免疫功能缺陷會(huì)導(dǎo)致感染性疾病和腫瘤的發(fā)生，對(duì)內(nèi)、外源抗原過(guò)度激活的免疫反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致自身免疫性疾病和過(guò)敏性疾病的發(fā)生[8-9]。

免疫細(xì)胞中的B細(xì)胞包含各種亞群，在天然免疫和適應(yīng)性免疫中均發(fā)揮重要作用，B細(xì)胞根據(jù)其對(duì)抗原的反應(yīng)特異性一般分為B1a，B1b和B2細(xì)胞。B1a細(xì)胞在PAMP刺激下直接分泌天然抗體，以低特異性清除一些常見(jiàn)的微生物，主要發(fā)揮天然免疫功能；B1b細(xì)胞在抗原和細(xì)胞因子刺激下以非T細(xì)胞依賴的方式分泌抗體，以較高的特異性介導(dǎo)體液免疫功能，但一般無(wú)免疫記憶功能[10-11]。B2細(xì)胞由骨髓中造血干細(xì)胞逐步分化形成原始B細(xì)胞（pre-pro-B cells）、祖B細(xì)胞（pro-B cells）和前B細(xì)胞（pre-B cells）等早期B細(xì)胞，然后繼續(xù)分化為表達(dá)B細(xì)胞受體（B-cell receptor，BCR）的T1，T2和T3期不成熟B細(xì)胞，最后再形成成熟B細(xì)胞[12-15]；成熟B細(xì)胞在抗原和輔助性T細(xì)胞共刺激分子及其分泌的細(xì)胞因子刺激下，分化為記憶性B細(xì)胞和漿細(xì)胞，漿細(xì)胞分泌大量高親和力抗體發(fā)揮高特異性體液免疫功能，記憶性B細(xì)胞則讓體液免疫反應(yīng)具有免疫記憶功能[16]。

各種B細(xì)胞不僅在天然免疫和適應(yīng)性免疫的體液免疫中發(fā)揮重要功能，同時(shí)B細(xì)胞的功能失調(diào)也在自身免疫性疾病和過(guò)敏性疾病的發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮重要作用。B細(xì)胞亞群及其組織分布的準(zhǔn)確分析，對(duì)開(kāi)發(fā)治療自身免疫性疾病和過(guò)敏性疾病的免疫調(diào)控藥物的活性評(píng)價(jià)十分重要[17]。目前，主要利用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)B細(xì)胞亞群進(jìn)行定性定量分析。然而，在流式分析中，還缺乏對(duì)B細(xì)胞亞群表面標(biāo)志物特異性的深入研究，各種文獻(xiàn)報(bào)道的B細(xì)胞亞群標(biāo)志物組合差異較大，同時(shí)也缺乏對(duì)不同組織分布的B細(xì)胞亞群流式分析的比較研究[10-16]。本研究通過(guò)多種B細(xì)胞表面標(biāo)志物的流式測(cè)定，優(yōu)化各種B細(xì)胞亞群的流式測(cè)定方法，同時(shí)也對(duì)各種組織中B細(xì)胞亞群進(jìn)行系統(tǒng)研究，為免疫調(diào)控藥物活性評(píng)價(jià)提供研究方法和基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、試劑和儀器

8周齡雄性BALB/c小鼠6只，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK（京）2016-0038。小鼠在清潔級(jí)環(huán)境自由飲水進(jìn)食3 d后用于實(shí)驗(yàn)。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)審批后進(jìn)行。死細(xì)胞染色劑7-氨基放線菌素D（7-aminoactinomycin D，7-AAD）、純化的大鼠抗小鼠單克隆抗體抗-CD16/CD32（2.4G2）和熒光標(biāo)記的大鼠抗小鼠單克隆抗體 APC-抗-B220（RA3-6B2）、PE-抗-CD11b（M1/70）、FITC-抗-CD43（S7）、PE-抗-CD138（281-2）及各熒光抗體的同型對(duì)照抗體，購(gòu)自美國(guó)BD Biosci?ences公司；熒光標(biāo)記大鼠抗小鼠單克隆抗體PE-Cy7-抗-CD5（53-7.3）、PE-抗-CD93（AA4.1）、PE-Cy7-抗-CD23（B3B4）、APC-Cy7-抗-IgM（RMM-1）、APC-Cy7-抗-CD27（LG.3A10）及各熒光抗體的同型對(duì)照抗體，購(gòu)自美國(guó)Biolegend公司；紅細(xì)胞裂解液（貨號(hào)：CC051），購(gòu)自中科邁晨科技有限公司；牛血清白蛋白（貨號(hào)：V900933），購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司；其他生化試劑，購(gòu)自北京化工廠。5424R臺(tái)型離心機(jī)，購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司；FACSCantoTMⅡ流式細(xì)胞儀，購(gòu)自美國(guó)BD Bio?sciences公司。

1.2 細(xì)胞樣本制備

利用0.5 mm直徑毛細(xì)玻璃管穿刺小鼠眼眶后靜脈叢，采集外周血到乙二胺四乙酸二鉀抗凝管中，取100 μL外周血到2 mL離心管中，加入1 mL紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞，4℃，300×g離心5 min，棄上清，然后重復(fù)1次裂解和離心，并棄上清；然后頸椎脫臼處死小鼠，利用注射器向小鼠腹腔注射5 mL細(xì)胞培養(yǎng)用磷酸鹽緩沖液（0.1 mol·L-1PBS，pH 7.4），輕柔推動(dòng)小鼠腹腔器官，3 min后，在小鼠腹腔中下部，剪開(kāi)1個(gè)小口，讓小鼠腹腔中液體流到5 mL離心管中；再剪開(kāi)小鼠腹腔，取脾和腹股溝淋巴結(jié)，放到40 μm孔徑的尼龍濾網(wǎng)上，一邊滴加10 mL PBS溶液，一邊利用注射器內(nèi)芯研磨脾和淋巴結(jié)組織，制備脾和淋巴結(jié)單細(xì)胞懸液；最后剪取小鼠一側(cè)股骨，利用1 mL注射器吸取PBS后刺入股骨膝關(guān)節(jié)端，將骨髓細(xì)胞沖洗到2 mL離心管中；在將其他各種細(xì)胞懸液吹散后，取1 mL腹腔灌洗液、100 μL脾細(xì)胞懸液、2 mL淋巴結(jié)細(xì)胞懸液、100 μL骨髓細(xì)胞懸液到2 mL離心管中（均為5×105～1×106），加入1 mL紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞，4℃，300×g離心5 min，棄上清。從裂解紅細(xì)胞步驟開(kāi)始，每只小鼠的每種細(xì)胞樣本均制備3份。

1.3 熒光抗體孵育

在制備好的外周血細(xì)胞、腹膜腔細(xì)胞、脾細(xì)胞、淋巴結(jié)細(xì)胞和骨髓細(xì)胞中，加入2 mL流式染色緩沖液（含0.2%牛血清白蛋白的PBS）清洗細(xì)胞，然后4℃，300×g離心5 min，棄上清，再加入200 μL流式染色緩沖液重懸細(xì)胞；每種細(xì)胞樣本中加入抗CD16/CD32抗體0.5 μg封閉IgG抗體受體，冰浴孵育15 min；然后每只小鼠的每種細(xì)胞分別進(jìn)行3種熒光抗體染色方案：①7-AAD、APC-抗-B220、PECy7-抗-CD5和PE-抗-CD11b染色（主要為區(qū)分B1和B2細(xì)胞亞群）；② 7-AAD、APC-抗-B220、FITC-抗-CD43、PE-抗-CD93、PE-Cy7-抗-CD23和APCCy7-抗-IgM染色（主要為區(qū)分各種不成熟和成熟B細(xì)胞亞群）；③ 7-AAD、APC-抗-B220、APC-Cy7-抗-CD27和PE-抗-CD138染色（主要為區(qū)分記憶性B細(xì)胞和漿細(xì)胞亞群）；7-AAD按說(shuō)明書(shū)推薦量加入細(xì)胞樣本中，各種熒光抗體加入各個(gè)樣本的量均為0.2 μg，另外設(shè)置空白染色管、每種熒光抗體的單標(biāo)管和3種染色方案的同型對(duì)照抗體管，將所有樣本與抗體混合均勻后冰浴30 min；最后加入1 mL流式染色緩沖液清洗細(xì)胞，4℃，300×g離心5 min，棄去上清，再重復(fù)清洗1次，棄上清，加入400 μL流式染色緩沖液重懸細(xì)胞。

1.4 流式細(xì)胞分析

在將流式細(xì)胞儀調(diào)試到工作狀態(tài)后，利用空白染色樣本、同型對(duì)照樣本、每種熒光抗體的單標(biāo)管樣本設(shè)置3種染色方案的前向和側(cè)向散射光電壓值、7-AAD和各種熒光染色的電壓值，然后設(shè)置好各熒光通道之間的熒光補(bǔ)償；最后收集各樣本細(xì)胞的前側(cè)向散射光和7-AAD及各種熒光抗體染色信號(hào)；在測(cè)定過(guò)程中，通過(guò)前側(cè)向散射光設(shè)置P1門(mén)，以去除細(xì)胞碎片和殘存的紅細(xì)胞，收集1×104個(gè)P1門(mén)細(xì)胞的檢測(cè)信息。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

利用Flowjo7分析流式細(xì)胞檢測(cè)的源文件，分析各種細(xì)胞樣本中B細(xì)胞在總細(xì)胞中的比例，同時(shí)也分析各種B細(xì)胞亞群在總B細(xì)胞中所占的比例，并用流式散點(diǎn)圖和直方圖表示；另外，利用Graph?Pad Prism 5.0分析各種組織細(xì)胞中的B細(xì)胞及B細(xì)胞亞群比例平均值的95%置信區(qū)間。

2 結(jié)果

2.1 外周血中B細(xì)胞及其亞群的比例

外周血經(jīng)2次裂解紅細(xì)胞和3種熒光抗體染色方案染色后，利用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行測(cè)定，通過(guò)7-AAD排除易受到非特異性染色的死細(xì)胞后，B220+的B細(xì)胞占總細(xì)胞的25%～58%，B220+CD5+的B1a細(xì)胞、B220+CD5-CD11b+的B1b細(xì)胞和B220+CD5-CD11b-的B2細(xì)胞分別占總B細(xì)胞的比例為3.0%～36%，1.8%～2.5%和60%～98%（圖1A和D）。B220+CD93+CD23-IgM+的未成熟B細(xì)胞和B220+CD93-CD23+IgMlow的成熟B細(xì)胞分別占總B細(xì)胞的比例為11%～22%和39%～49%（圖1B和D）。B220+CD27+CD138-的記憶性B細(xì)胞和B220+CD27-CD138+的漿細(xì)胞分別占總B細(xì)胞的比例為0.2%～8.0%和0.3%～8.8%（圖1C和D）。

2.2 腹膜腔中B細(xì)胞及其亞群的比例

腹膜腔細(xì)胞經(jīng)離心濃縮、裂解紅細(xì)胞和3種熒光抗體染色方案染色后，利用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行測(cè)定，通過(guò)7-AAD排除容易受到非特異性染色的死細(xì)胞后，B220+的B細(xì)胞占總細(xì)胞的40%～57%，B220+CD5+的B1a細(xì)胞、B220+CD5-CD11b+的B1b細(xì)胞和B220+CD5-CD11b-的B2細(xì)胞分別占總B細(xì)胞的比例為26%～91%，1.1%～27%和7.6%～46%（圖2A和D）。B220+CD27+CD138-記憶性B細(xì)胞和B220+CD27-CD138+的漿細(xì)胞分別占總B細(xì)胞的比例為1.2%～2.8%和1.1%～2.8%（圖2C和D）。

2.3 脾中B細(xì)胞及其亞群的比例

Fig.1 Percentages of B cells and B-cell subgroups in peripheral blood of mice analyzed with flow cytometry.Peripheral blood was collected and red cells were depleted by osmotic lysis.The remaining cells were stained with three combinations of fluores?cent dye and fluorescent-conjugated antibodies.A：7-AAD，APC-anti-B220，PE-Cy7-anti-CD5 and PE-anti-CD11b；B：7-AAD，APC-anti-B220，F(xiàn)ITC-anti-CD43，PE-anti-CD93，PE-Cy7-anti-CD23 and APC-Cy7-anti-IgM；C：7-AAD，APC-anti-B220，APC-Cy7-anti-CD27 and PE-anti-CD138；D：percentages of B cells in total cells and percentages of B-cell subgroups in B cells.PC：plasma cells.

Fig.2 Percentages of B cells and B-cell subgroups in peritoneal cavity of mice analyzed with flow cytometry.Cells in the peritoneal cavity were collected with 5 mL PBS lavage，and red cells were depleted by osmotic lysis.The remaining cells were stained with three combinations of fluorescent dye and fluorescent-conjugated antibodies.A：7-AAD，APC-Anti-B220，PE-Cy7-anti-CD5 and PE-anti-CD11b；B：7-AAD，APC-anti-B220，F(xiàn)ITC-anti-CD43，PE-anti-CD93，PE-Cy7-anti-CD23 and APC-Cy7-anti-IgM；C：7-AAD，APC-anti-B220，APC-Cy7-anti-CD27 and PE-anti-CD138；D：percentages of B cells in total cells and percentages of B-cell subgroups in B cells.

脾經(jīng)研磨制備為單細(xì)胞懸液并裂解紅細(xì)胞后，通過(guò)3種熒光抗體染色方案染色，然后利用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行測(cè)定，通過(guò)7-AAD排除易受到非特異性染色的死細(xì)胞后，B220+的B細(xì)胞占總細(xì)胞的52%～61%，B220+CD5+的B1a細(xì)胞、B220+CD5-CD11b+的B1b細(xì)胞和B220+CD5-CD11b-的B2細(xì)胞分別占總B細(xì)胞的比例為13%～19%，2.1%～3.1%和79%～85%（圖3A和D）。B220+CD43-CD93+CD23-IgM-的Pre-B細(xì)胞、B220+CD43-CD93+CD23-IgM+的T1 B細(xì)胞、B220+CD43-CD93+CD23+IgM+的T2 B細(xì)胞、B220+CD43-CD93+CD23+IgMlow的T3 B細(xì)胞、不成熟B 細(xì)胞（T1+T2+T3）、B220+CD43-CD93-CD23+IgMlow的成熟B細(xì)胞和B220+CD43-CD93-CD23-IgM+的邊緣區(qū) B細(xì)胞（marginal B）等7種B細(xì)胞亞群分別占總B細(xì)胞的比例為0.19%～0.74%，3.7%～4.0%，1.8%～2.7%，0.38%～0.76%，6.2%～7.1%，54%～59%和6.5%～11%（圖3B和D）。B220+CD27+CD138-的記憶性B細(xì)胞和B220+CD27-CD138+的漿細(xì)胞分別占總B細(xì)胞的比例為2.0%～3.4%和0.9%～1.2%（圖3C和D）。

2.4 淋巴結(jié)中B細(xì)胞及其亞群的比例

腹股溝淋巴結(jié)經(jīng)研磨制備為單細(xì)胞懸液并裂解紅細(xì)胞后，通過(guò)3種熒光抗體染色方案染色，然后利用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行測(cè)定，通過(guò)7-AAD排除容易受到非特異性染色的死細(xì)胞后，B220+的B細(xì)胞占總細(xì)胞的4.6%～36%，B220+CD5+的B1a細(xì)胞、B220+CD5-CD11b+的 B1b 細(xì)胞和B220+CD5-CD11b-的B2細(xì)胞分別占總B細(xì)胞的比例為4.6%～26%，1.3%～2.9%和72%～92%（圖4A和D）。B220+CD43-CD93-CD23+IgMlow的成熟B細(xì)胞占總B細(xì)胞的比例為61%～71%（圖4B和D）。B220+CD27+CD138-的記憶性B細(xì)胞和B220+CD27-CD138+的漿細(xì)胞分別占總B細(xì)胞的比例為2.6%～3.3%和0.9%～2.6%（圖4C和D）。

2.5 骨髓中B細(xì)胞及其亞群的比例

Fig.3 Percentages of B cells and B-cell subgroups in spleen analyzed with flow cytometry.The spleen was dissected，homogenized，and passed through a 40 μm mesh to generate single-cell suspension.Red cells were depleted by osmotic lysis.The remaining splenocytes were stained with three combinations of fluorescent dye and fluorescent-conjugated antibodies.A：7-AAD，APC-anti-B220，PE-Cy7-anti-CD5 and PE-anti-CD11b；B：7-AAD，APC-anti-B220，F(xiàn)ITC-anti-CD43，PE-anti-CD93，PE-Cy7-anti-CD23 and APC-Cy7-anti-IgM；C：7-AAD，APC-anti-B220，APC-Cy7-anti-CD27 and PE-anti-CD138；D：percentage of B cells in total cells and percentages of B-cell subgroups in B cells analyzed.

Fig.4 Percentages of B cells and B-cell subgroups in lymph node with flow cytometry.The inguinal lymph node cells were removed，homogenized，and passed through a 40 μm mesh to generate single-cell suspension.Red cells were depleted by osmotic lysis.The remaining cells were stained with three combinations of fluorescent dye and fluorescent-conjugated antibodies.A：7-AAD，APC-anti-B220，PE-Cy7-anti-CD5 and PE-anti-CD11b；B：7-AAD，APC-anti-B220，F(xiàn)ITC-anti-CD43，PE-anti-CD93，PE-Cy7-anti-CD23 and APC-Cy7-anti-IgM；C：7-AAD，APC-anti-B220，APC-Cy7-anti-CD27 and PE-anti-CD138；D：percentage of B cells in total cells and percentages of B-cell subgroups in B cells analyzed.

Fig.5 Percentages of B cells and B-cell subgroups in bone marrow analyzed with flow cytometry.The bone marrow cells were flushed out from bone marrow of femur.Red cells were depleted by osmotic lysis.The remaining cells were stained with three combinations of fluorescent dye and fluorescent-conjugated antibodies.A：7-AAD，APC-anti-B220，PE-Cy7-anti-CD5 and PE-anti-CD11b；B：7-AAD，APC-anti-B220，F(xiàn)ITC-anti-CD43，PE-anti-CD93，PE-Cy7-anti-CD23 and APC-Cy7-anti-IgM；C：7-AAD，APC-anti-B220，APC-Cy7-anti-CD27 and PE-anti-CD138；D：percentage of B cells in total cells and percentages of B-cell subgroups in B cells.

收集股骨骨髓細(xì)胞并吹散為單細(xì)胞懸液以及裂解紅細(xì)胞后，通過(guò)3種熒光抗體染色方案染色，然后利用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行測(cè)定，通過(guò)7-AAD排除易受到非特異性染色的死細(xì)胞后，B220+的B細(xì)胞占總細(xì)胞的29%～46%，B220+CD5+的B1a細(xì)胞、B220+CD5-CD11b+的B1b細(xì)胞和B220+CD5-CD11b-的B2細(xì)胞分別占總B細(xì)胞的比例為0.9%～4.6%，5.5%～12%和82%～92%（圖5A和D）。B220+CD43+CD93+CD23-IgM-的pro-B細(xì)胞、B220+CD43-CD93+CD23-IgM-的 pre-B 細(xì)胞、B220+CD43-CD93+CD23-IgM+的T1 B細(xì)胞、B220+CD43-CD93+CD23+IgM+的 T2 B 細(xì)胞、B220+CD43-CD93+CD23+IgMlow的T3 B細(xì)胞、不成熟B細(xì)胞（T1+T2+T3）和B220+CD43-CD93-CD23+IgMlow的成熟B細(xì)胞等7種B細(xì)胞亞群分別占總B細(xì)胞的比例為0.8%～3.9%，35%～54%，19%～36%，0.1%～2.4%，0.7%～1.3%，20%～40%和5.9%～8.9%（圖5B和D）。B220+CD27+CD138-的記憶性B細(xì)胞和B220+CD27-CD138+的漿細(xì)胞分別占總B細(xì)胞的比例為0.4%～1.6%和0.3%～2.1%（圖5C和D）。

3 討論

通過(guò)多參數(shù)和多種組織中B細(xì)胞及其亞群的流式細(xì)胞分析，本研究可以很好地觀察到各種B細(xì)胞亞群標(biāo)志物的特異性。對(duì)于第①種區(qū)分B1a，B1b和B2細(xì)胞的染色方案，CD5主要表達(dá)在B1a細(xì)胞和T細(xì)胞表面，CD11b主要表達(dá)在B1細(xì)胞、粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞表面。因此，首先要利用B220準(zhǔn)確設(shè)門(mén)圈定B細(xì)胞，然后再根據(jù)CD5和CD11b確定B1a，B1b和B2細(xì)胞。然而，對(duì)于腹膜腔B細(xì)胞，由于富含B220表達(dá)水平低的B1細(xì)胞，僅利用B220設(shè)門(mén)的直方圖不易將B細(xì)胞和非B細(xì)胞區(qū)分開(kāi)，可以通過(guò)前側(cè)向散射光去除巨噬細(xì)胞群或B220和CD11b二維散點(diǎn)圖去除CD11b強(qiáng)陽(yáng)性的巨噬細(xì)胞，再設(shè)門(mén)確定B1a，B1b和B2細(xì)胞的比例。

對(duì)于第②種主要區(qū)分不成熟和成熟B細(xì)胞亞群的染色方案，CD43主要表達(dá)于B1細(xì)胞、pro-B細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞上，CD93表達(dá)于pro-B、pre-B和各種不成熟B細(xì)胞上，CD23表達(dá)主要表達(dá)于成熟B細(xì)胞上，同時(shí)也表達(dá)于T2和T3期不成熟B細(xì)胞上，IgM表達(dá)于不成熟和成熟B細(xì)胞上，其中T3期B細(xì)胞和成熟B細(xì)胞表達(dá)低水平IgM。在通過(guò)B220設(shè)門(mén)去除非B細(xì)胞后，再利用CD93，CD23和IgM的表達(dá)情況可以確定各種原始B細(xì)胞、不成熟B細(xì)胞、成熟B細(xì)胞和邊緣區(qū)B細(xì)胞亞群比例。但本研究在這種染色方案中發(fā)現(xiàn)幾個(gè)問(wèn)題。首先，外周血中不成熟B細(xì)胞，主要是約占15%的CD43+CD93+CD23-IgM+細(xì)胞，這不同于骨髓中不成熟B細(xì)胞，骨髓中B細(xì)胞是由CD43+CD93+CD23-IgM-的 pro-B 細(xì)胞、CD43-CD93+CD23-IgM-的pre-B細(xì)胞和CD43-CD93+CD23-/+IgM+的不成熟B細(xì)胞逐次發(fā)育而來(lái)，外周血中CD43+CD93+CD23-IgM+細(xì)胞可能是由骨髓中pro-B細(xì)胞進(jìn)入外周血直接發(fā)育而來(lái)，在出現(xiàn)IgM表達(dá)后CD43還未消失，或者骨髓不成熟B細(xì)胞進(jìn)入外周血后CD43暫時(shí)性的表達(dá)。其次，脾和淋巴結(jié)中存在一種B220+CD43+CD93-CD23+IgMlow的細(xì)胞亞群，其可能不是pro-B細(xì)胞，而是一種特殊的成熟B細(xì)胞亞群或漿細(xì)胞樣樹(shù)突狀細(xì)胞，具體類型還需要進(jìn)一步研究。第三，CD93較特異表達(dá)于pro-B、pre-B和不成熟B細(xì)胞，但發(fā)現(xiàn)在腹膜腔巨噬細(xì)胞上高表達(dá)CD93，由于腹膜腔巨噬細(xì)胞和B1細(xì)胞也同時(shí)高表達(dá)CD43，因此，第②種染色方案不適合區(qū)分腹膜腔中早期發(fā)育階段的B細(xì)胞，但可結(jié)合第①種染色方案區(qū)分B1和B2細(xì)胞。最后值得一提的是，在外周血和脾細(xì)胞中，有一群特別高表達(dá)IgM的成熟B細(xì)胞亞群，可能是IgM陽(yáng)性的記憶性B細(xì)胞。

第③種染色方案主要用于區(qū)分記憶性B細(xì)胞和漿細(xì)胞，其中CD27主要表達(dá)于記憶性B細(xì)胞和T細(xì)胞上，CD138主要表達(dá)于漿細(xì)胞和上皮細(xì)胞上，在利用B220準(zhǔn)確設(shè)門(mén)圈定B細(xì)胞后，該種染色方案可以較特異性地分析各種組織中記憶性B細(xì)胞和漿細(xì)胞。除此之外，可以結(jié)合第②種染色方案中IgM抗體染色以及IgG抗體染色，進(jìn)一步對(duì)記憶性B細(xì)胞進(jìn)行特異性標(biāo)記和亞群分類。同時(shí)也可以利用更多檢測(cè)參數(shù)提高漿細(xì)胞檢測(cè)的特異性。

綜合3種熒光抗體染色方案，本研究特異準(zhǔn)確地揭示了各種B細(xì)胞亞群在各種組織中的的定量分布情況：外周血中主要包含成熟B細(xì)胞和一種特殊的不成熟B細(xì)胞；腹膜腔中主要包含B1a細(xì)胞和成熟B細(xì)胞；脾中主要包含成熟B細(xì)胞、邊緣區(qū)B細(xì)胞、T1和T2期不成熟B細(xì)胞；淋巴結(jié)中主要包含成熟B細(xì)胞；骨髓中包含各種發(fā)育階段B細(xì)胞，主要包含pre-B細(xì)胞和T1期不成熟B細(xì)胞，同時(shí)也是唯一含有較多pro-B細(xì)胞的組織。記憶性B細(xì)胞和漿細(xì)胞在各種組織中都只占B細(xì)胞的較小比例，均≤3%，在外周血、淋巴結(jié)和脾中含有相對(duì)較高的記憶性B細(xì)胞（>2%），在腹膜腔中含有相對(duì)較高的漿細(xì)胞（1.76%）。另外，特別值得關(guān)注的是外周血中CD43+CD93+CD23-IgM+不成熟B細(xì)胞和脾及淋巴結(jié)中存在的B220+CD43+CD93-CD23+IgMlow的細(xì)胞亞群，其更多的細(xì)胞特征和功能還需要進(jìn)一步研究。本研究共檢測(cè)了6只8周齡雄性BALB/c小鼠的B細(xì)胞亞群組織分布，實(shí)驗(yàn)個(gè)體之間數(shù)據(jù)變異很小，結(jié)果可信度高。當(dāng)然，如果繼續(xù)增加實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)量和不同性別、不同年齡及種屬動(dòng)物的B細(xì)胞亞群組織分布分析，將能為B細(xì)胞研究提供更多基礎(chǔ)資料。

綜上所述，通過(guò)不同組織中B細(xì)胞亞群及非B細(xì)胞亞群表面多種表面標(biāo)志物表達(dá)，可以根據(jù)需要檢測(cè)的具體組織和細(xì)胞類型，選擇合適的標(biāo)志物和設(shè)門(mén)方法進(jìn)行優(yōu)化的B細(xì)胞亞群分析。如果設(shè)備、試劑條件許可及實(shí)驗(yàn)需要，也可以利用更多參數(shù)進(jìn)行一次性流式檢測(cè)分析，在準(zhǔn)確分析B細(xì)胞亞群及其在各種組織中分布的同時(shí)，分析各種B細(xì)胞亞群的活化、增殖和細(xì)胞內(nèi)蛋白表達(dá)變化，從而更好地用于免疫調(diào)控藥物活性評(píng)價(jià)和作用機(jī)制研究。