彭艷紅，吳東寧，滕丹，白光，王慶峰

1.遼寧中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，遼寧 沈陽 110032；2.北京豐臺右安門醫(yī)院，北京 100069；3.遼寧何氏醫(yī)學院，遼寧 沈陽 110163；4.遼寧中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結(jié)合學院，遼寧 沈陽 110032

反流性食管炎（reflux esophagitis，RE）是消化內(nèi)科常見疾病，為胃及十二指腸內(nèi)容物反流入食管，最終引起的食管炎癥性病變[1]。RE 可發(fā)生于任何年齡人群，成人發(fā)病率隨年齡增長而升高。其發(fā)病機制有反流屏障受損、反流物侵蝕作用、胃排空障礙、幽門螺桿菌感染，以及炎癥介導(dǎo)因子等。RE 中醫(yī)病機可概括為肝膽失于疏泄，胃失和降，導(dǎo)致胃氣上逆，上犯食管，其臨床常見證型為肝胃不和[2]。疏肝利膽和胃方由半夏、黃芩、柴胡、枳實、蒲公英、砂仁、浙貝母、白及、白芷、茯苓組成，乃國醫(yī)大師周學文所創(chuàng)，宗半夏瀉心湯、小柴胡湯、四逆散、參苓白術(shù)散、烏貝散之義，辛苦同進，升降并用，補瀉兼施，共奏疏肝理氣、健脾和胃、降逆止嘔之功。但其作用機制尚不明確。

目前，中藥復(fù)方作用機制分析已由單一靶點或信號通路過渡到以網(wǎng)絡(luò)藥理學為代表的系統(tǒng)生物學和多向藥理學研究[3]。通過生物信息學手段，可對復(fù)方的物質(zhì)基礎(chǔ)及作用分子靶點進行網(wǎng)絡(luò)融合，并進一步應(yīng)用數(shù)據(jù)庫工具探索復(fù)方的起效機制。然而，網(wǎng)絡(luò)藥理學研究大多通過分析多成分-多靶點網(wǎng)絡(luò)作用關(guān)系探討復(fù)方的整體作用[4-5]，雖然符合中醫(yī)的整體觀念及辨證論治特性，但對復(fù)方中重要藥對的配伍關(guān)系分析不足。因此，如何應(yīng)用現(xiàn)有技術(shù)對復(fù)方內(nèi)的藥物組成關(guān)系進行深入研究，并進一步考察組方的配伍關(guān)系，是網(wǎng)絡(luò)藥理學處理復(fù)雜復(fù)方的難題之一。為此，本研究除采用網(wǎng)絡(luò)藥理學方法對疏肝利膽和胃方進行數(shù)據(jù)挖掘外，應(yīng)用主坐標分析（principal coordinate analysis，PCoA）考察方中藥味之間的相互關(guān)系，并進一步分析復(fù)方作用的核心分子靶點，預(yù)測疏肝利膽和胃方治療RE 的物質(zhì)基礎(chǔ)及機制，以期為同類研究提供方法學參考。

1 資料與方法

1.1 疏肝利膽和胃方相關(guān)數(shù)據(jù)集采集與處理

通過中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP，http://lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp.php）檢索疏肝利膽和胃方中各藥物的化學成分及對應(yīng)分子靶點。遵照Lipinski 規(guī)則對所獲得的化學成分進行篩選，篩選條件[6]:①分子量（MW）＜500；②脂水分配系數(shù)（Alog P）≤5；③氫鍵供體數(shù)目（Hdon）≤5；④氫鍵受體數(shù)目（Hacc）≤10。獲得疏肝利膽和胃方的主要化學成分。利用Excel2016 整理上述有效成分對應(yīng)的分子靶點信息，建立藥物（橫坐標）-分子靶點（縱坐標）數(shù)據(jù)集，該數(shù)據(jù)集內(nèi)的數(shù)值為藥物作用不同分子靶點的重復(fù)值。

1.2 疏肝利膽和胃方藥物聚類描述

①采用 Omicshare3.0 軟件（ https://www.omicshare.com）對所得數(shù)據(jù)集進行PCoA:依據(jù)方中各藥物對應(yīng)的分子靶點重復(fù)值，統(tǒng)計各分子靶點的集中度。②采用Omicshare3.0 軟件對所得重復(fù)值信息制作關(guān)系距離熱圖（bray 算法），并根據(jù)熱圖色塊的變化情況分析方中各藥物分子靶點的集中度關(guān)系。③以O(shè)micshare3.0 軟件對獲得的各藥物集中度差異情況制作PCoA 圖，最終確定各藥物之間的相互關(guān)系。④對“1.1”項下全部藥物作用的分子靶點重復(fù)總值排序，取前50，將其定義為核心分子靶點。應(yīng)用TBtools V0.66 軟件的Heatmap 包對上述靶點的重復(fù)值做均一化處理后，制作熱圖，以考察上述核心分子靶點在各藥物內(nèi)的分布情況，確定各味藥在疏肝利膽和胃方內(nèi)的權(quán)重。

1.3 反流性食管炎背景網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

①通過CTD 數(shù)據(jù)庫（http://ctdbase.org/）[7]篩選RE 相關(guān)的分子靶點:在“Diseases”搜索框中輸入“reflux esophagitis”，獲得RE 的分子靶點信息，并將其定義為RE 背景網(wǎng)絡(luò)。②考慮到RE 背景網(wǎng)絡(luò)內(nèi)的靶點信息較多，以相關(guān)性系數(shù)（inference score）＞20及參考文獻數(shù)量（reference count）＞10 對RE 的背景網(wǎng)絡(luò)進行篩選，獲得RE 核心背景網(wǎng)絡(luò)。

1.4 疏肝利膽和胃方治療反流性食管炎潛在靶點及功能富集

①以“1.1”項下疏肝利膽和胃方對應(yīng)的分子靶點對“1.3”項下RE 背景網(wǎng)絡(luò)及RE 核心背景網(wǎng)絡(luò)分別進行映射，獲得疏肝利膽和胃方治療RE 的潛在靶點，綜合“1.1”項下方中各藥物有效化學成分信息，應(yīng)用Cytoscape3.7.2 軟件對映射所得靶點構(gòu)建“藥物-有效成分-分子靶點”網(wǎng)絡(luò)及“藥物-有效成分-核心分子靶點”網(wǎng)絡(luò)。②以“1.2”項下核心分子靶點對上述網(wǎng)絡(luò)進行映射，獲得疏肝利膽和胃方治療RE 的潛在核心靶點。③應(yīng)用 WebGestalt 數(shù)據(jù)庫（http://www.webgestalt.org）[8]及Cytoscape3.7.1 軟件的ClueGO 包，對①中獲得的核心分子靶點分別進行GO 功能富集和KEGG 通路富集，以確定疏肝利膽和胃方治療RE 的分子機制。

2 結(jié)果

2.1 疏肝利膽和胃方主要成分作用靶點

經(jīng)TCMSP 數(shù)據(jù)庫檢索及數(shù)據(jù)篩選，共獲得疏肝利膽和胃方中10 個藥物的369 個有效成分，刪除重復(fù)值后，共獲212 個唯一有效成分。有效成分及靶點分布情況見表1。

以相關(guān)性系數(shù)＞20、參考文獻數(shù)量＞10 對RE 背景網(wǎng)絡(luò)進行篩選，獲得73 個靶點。以上述73 個分子靶點及“2.1”項下獲得的藥物、有效成分及分子靶點數(shù)據(jù)庫的分布情況，構(gòu)建“藥物-有效成分-核心分子靶點”網(wǎng)絡(luò)，見圖4。可知，疏肝利膽和胃方作用于RE 核心分子靶點的藥物仍以半夏有效成分最多（38個），另有蒲公英（2 個）、砂仁（1 個）、枳實（1 個）及黃芩（1 個），其他藥物并未出現(xiàn)在該網(wǎng)絡(luò)中，提示這5 種藥物為疏肝利膽和胃方治療RE 的核心藥物，其中以半夏最為重要。該網(wǎng)絡(luò)內(nèi)17 個分子靶點的平均度值為5.65，共有11 個分子靶點大于平均度值。同時，以上述靶點對“2.2”項下篩選出的50 個核心靶點進行映射，最終得出疏肝利膽和胃方治療RE 的核心靶點為PTGS2 及BCL2L1。

2.4 疏肝利膽和胃方對反流性食管炎的治療機制

對圖4 篩選出的17 個靶點進行GO 功能富集和KEGG 通路分析，結(jié)果見圖5、圖6?？芍?，疏肝利膽和胃方對RE 的治療機制主要集中于炎癥反應(yīng)抑制，涉及NF-κB 通路、TNF 通路、IL-17 通路、花生四烯酸代謝通路、FoxO 通路和PI3K-Akt 通路等多條炎癥通路；而AMPK 信號通路主要調(diào)節(jié)食管的能量代謝。上述結(jié)果表明，疏肝利膽和胃方可通過一系列信號通路，多角度、多靶點緩解RE 的發(fā)生和發(fā)展。

圖4 疏肝利膽和胃方治療RE 的藥物-有效成分-核心分子靶點網(wǎng)絡(luò)

圖5 疏肝利膽和胃方治療RE 核心靶點KEGG 通路富集

圖6 疏肝利膽和胃方治療RE 核心靶點GO 功能富集

3 討論

疏肝利膽和胃方舒肝利膽、降逆止嘔?，F(xiàn)代藥理學研究表明，方中半夏可抑制嘔吐中樞[9]，黃芩、柴胡可抗炎鎮(zhèn)痛[10-11]。目前針對該方組成藥物治療RE的研究多集中于半夏。郭震浪等[12]關(guān)于半夏瀉心湯治療RE 的Mate 分析顯示，與西藥比較，半夏瀉心湯可有效提高RE 的臨床療效。另外，半夏厚樸湯、小半夏湯等方劑治療RE 效果也較佳[13-14]。然而，現(xiàn)有研究多集中于療效觀察，對其治療機制研究較少。

為理清疏肝利膽和胃方的作用機制，本研究嘗試應(yīng)用PCoA 考察組方藥物之間的配伍關(guān)系。由分析結(jié)果可知，君藥半夏與臣藥白芷、砂仁關(guān)系較為密切，而另一君藥黃芩與臣藥柴胡、枳實關(guān)系較為密切。推測上述兩君藥分別與四臣藥構(gòu)成不同的功能模塊。半夏模塊以消痞散結(jié)為主，白芷、砂仁理氣效果好，可配合半夏消痞；黃芩清胃經(jīng)、膽經(jīng)濕熱，配合柴胡、枳實入肝經(jīng)，進一步疏肝解郁。茯苓利水滲濕，加速肝膽濕熱排出，與其他藥物的功效有較大差異，因此在PCoA 圖中距離其他藥物的聚類靶點較遠。由上述結(jié)果可知，PCoA 配合網(wǎng)絡(luò)藥理學對復(fù)雜方劑進行研究從技術(shù)上是可行的。

本研究獲得的“藥物-有效成分-分子靶點”網(wǎng)絡(luò)中，黃芩素、沒食子酸、6-姜烯酚、β-欖香烯及咖啡酸等自由度較高，然而，上述幾個潛在有效成分并無針對RE 的相關(guān)報道。黃芩素作為自由度最高的有效成分，其有較好的抗炎活性。高東等[15]研究表明，黃芩素可直接降低胃潰瘍模型大鼠血清丙二醛、三葉因子1、三葉因子2 及胃黏膜前列腺素E2、表皮生長因子的表達，可將其視為疏肝利膽和胃方的重要有效成分。與黃芩素類似，沒食子酸[16]、6-姜烯酚[17]等成分多以抗炎作用起效。

在“藥物-有效成分-核心分子靶點”網(wǎng)絡(luò)中，自由度較高的分子靶點分別為PTGS2（前列素內(nèi)環(huán)氧化物合成酶2）、TP53（腫瘤蛋白53）、CASP3（半胱氨酸蛋白酶3）、CASP9（半胱氨酸蛋白酶9）、BCL2L1（人BCL2 樣蛋白1）、RELA（細胞核因子κp65）、BCL2（B 淋巴細胞瘤2）、BAX（促凋亡因子）、TNF（腫瘤壞死因子）等14 個靶點。其中，PTGS2 及BCL2L1 被定義為疏肝利膽和胃方治療RE 的核心分子靶點。PTGS2 也稱為環(huán)氧合酶-2（COX-2），其過表達可增加局部組織前列腺素的合成，刺激炎癥反應(yīng)。作為炎癥疾病，RE 患者食管黏膜PTGS2 表達水平與食管遠端酸暴露呈正相關(guān)[18]。作為重要的抑癌因子，TP53 與食管癌的關(guān)系被廣泛報道[19]，其下游蛋白p53 與RE 的發(fā)病關(guān)系極為密切:p53 往往與食管黏膜暴露、細胞增生加速相關(guān)，而過度的酸堿刺激會進一步上調(diào)p53 的表達[20]，因此，抑制TP53 可有效阻遏下游蛋白的表達，起到緩解細胞增生的作用。Casp9 及Casp3 是疏肝利膽和胃方治療RE 的重要調(diào)節(jié)分子靶點，Casp9 是Casp3 重要的上游蛋白。程靜等[21]研究表明，Casp3 下調(diào)與胃黏膜的損傷程度密切相關(guān)。隨RE 誘發(fā)的炎癥反應(yīng)，Casp3 下調(diào)會抑制凋亡通路，導(dǎo)致食管上皮鱗狀細胞異常增殖（癌變的前兆）[22]。另一方面，RE 的炎癥損傷會介導(dǎo)Casp3 過表達，誘導(dǎo)胃黏膜細胞的凋亡。作為Caspase 通路的上游信號因子，靶點Bax、Bcl2 及Bcl2L1 的分子功能主要是通過調(diào)控下游的Casp3 介導(dǎo)后續(xù)的細胞凋亡程序[23]。與上述3 個靶點類似，TNF 可通過TNF→TNFR1 的結(jié)合，激活FADD 形成Casp8 和Casp10 的前體，并進一步激活下游的Casp8 和Casp10；通過AKT→Bad 通路生成Casp9，并與Casp8 和Casp10 生成Casp3 前體，介導(dǎo)后續(xù)的凋亡程序[24]。RELA 是重要的炎癥調(diào)控蛋白，雖然尚無其與RE 相關(guān)性的報道，但RELA 在多種炎癥疾病中的上調(diào)趨勢與炎癥的病變程度正相關(guān)[25-26]，提示RELA 是抑制RE 炎癥反應(yīng)的重要靶點。綜上可知，疏肝利膽和胃方可通過調(diào)節(jié)上述分子靶點實現(xiàn)對RE 的治療作用。

從分子靶點的KEGG 通路富集結(jié)果可知，疏肝利膽和胃方治療RE 涉及NF-κB 通路、TNF 通路、AMPK通路、IL-17 通路、花生四烯酸代謝通路、FoxO 通路、PI3K-Akt 通路和胃酸分泌等。NF-κB 通路是調(diào)控大量炎癥信號因子的信號中樞，可直接激活炎癥反應(yīng)[27]，該信號通路廣泛參與細胞的炎癥反應(yīng)、細胞增殖、分化與凋亡，以及各類免疫反應(yīng)；TNF 通路是其下游通路，在炎癥反應(yīng)的發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用[24]。FoxO通路主要通過對下游NF-κB 及TNF 等通路的抑制實現(xiàn)其功能，祁永福等[28]研究顯示，通過對FOXO4/NF-κB/TNF-α 炎癥信號通路的調(diào)控，可以有效緩解RE 的炎癥反應(yīng)及食管損傷。PI3K-Akt 通路也是NF-κB 的上游通路，抑制PI3K/Akt 信號通路可減少多種炎癥因子的釋放，通過抑制該通路可有效減緩RE 進展[29]。白細胞介素（IL）-23 誘導(dǎo)IL-17 產(chǎn)生的細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)通路，形成IL-23/IL-17 炎癥軸[30]，其在許多慢性炎癥及免疫系統(tǒng)疾病的發(fā)病過程中起關(guān)鍵作用[31]，而IL-17 信號通路也是RE 治療的重要靶點[32]。疏肝利膽和胃方對IL-17 信號通路的抑制，可視為其對炎癥反應(yīng)抑制的重要機制之一。AMPK 信號通路與細胞能量代謝有關(guān)，在RE 發(fā)病過程中，隨AMPK 信號通路的阻遏，細胞內(nèi)生成的ATP 被過度分解，食管組織內(nèi)ATP 不足以維持食管肌肉收縮所需，降低了括約肌壓力，其抗反流的屏障作用隨之減弱[33]。由上述結(jié)果可知，疏肝利膽和胃方治療RE 的機制是對多條炎癥通路的抑制，同時可調(diào)節(jié)食管細胞的能量代謝，最終保護食管。

RE 發(fā)生是多靶點共同作用的結(jié)果，伴隨著相應(yīng)的信號通路傳導(dǎo)，最終實現(xiàn)其炎癥反應(yīng)，并導(dǎo)致相應(yīng)的細胞損傷。本研究借助生物信息學手段對疏肝利膽和胃方進行分析，揭示了組方藥物的作用關(guān)系及核心作用靶點，并進一步應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學手段，對該方治療RE 的分子靶點進行分析，闡釋了疏肝利膽和胃方治療RE 的潛在作用機制。今后研究可針對上述靶點及通路進行驗證，以確定疏肝利膽和胃方作用的確切分子機制。