王鑫蕊

摘 要： 工業(yè)用脂肪酶主要來(lái)源于酵母和細(xì)菌，最適溫度和pH范圍多為35～45℃和6.5～8.0，適應(yīng)中低溫和偏中性的應(yīng)用環(huán)境。目前，中低溫脂肪酶在工業(yè)應(yīng)用中存在一些普遍問(wèn)題，如高溫或堿性等條件下易失活等，這在一定程度上限制了脂肪酶的工業(yè)應(yīng)用。在此背景下，人們逐漸關(guān)注來(lái)自于極端微生物的極端脂肪酶資源的挖掘，如嗜熱脂肪酶、堿性脂肪酶、低溫脂肪酶及綜合多極端脂肪酶等，以達(dá)到工業(yè)應(yīng)用要求。其中，嗜熱脂肪酶多從嗜熱菌中分離得到，具有催化效率高、冷卻能耗低、改善底物可溶性等優(yōu)點(diǎn)，且在應(yīng)用時(shí)較中低溫酶更穩(wěn)定。耐堿脂肪酶則多從土壤、鹽堿湖的耐堿菌中分離得到，常用于洗滌清潔工業(yè)。目前報(bào)道的嗜熱耐堿脂肪酶多來(lái)源于芽孢桿菌，其適宜溫度在40～60℃之間，最適pH在7.0～9.0之間。本文主要對(duì)微生物脂肪酶的性質(zhì)及應(yīng)用做論述。

關(guān)鍵詞： 微生物;脂肪酶;性質(zhì);應(yīng)用

【中圖分類(lèi)號(hào)】TU74 ? ? 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A ? ? 【文章編號(hào)】1674-3733（2020）13-0246-01

引言

生物催化劑因其環(huán)保、高效和特異性等特點(diǎn)而廣泛應(yīng)用于各工業(yè)領(lǐng)域。脂肪酶是自然界中最具潛力的工業(yè)酶之一，能催化水解、酯化、酯交換等反應(yīng)，在食品營(yíng)養(yǎng)、油脂化學(xué)工業(yè)等方面有較好應(yīng)用。微生物也是酶資源的重要來(lái)源，微生物酶的研究從20世紀(jì)90年代開(kāi)始興起，以蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等產(chǎn)業(yè)價(jià)值高的酶類(lèi)作為主要研究對(duì)象。微生物的低溫酶與耐鹽酶等結(jié)構(gòu)和功能新穎的極端酶憑借其獨(dú)特的催化作用大大拓寬了微生物酶的應(yīng)用范圍，也給酶工程的研究帶來(lái)了新的思路和方向。

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

大腸桿菌Top10和BL21菌株由本實(shí)驗(yàn)室保存。引物由上海生工有限公司合成。TaqDNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶和T4DNALigase購(gòu)于Takara生物技術(shù)公司。胰化蛋白胨、酵母提取物等購(gòu)于Oxoid公司，常用生物試劑卡那霉素、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）購(gòu)于BIOFROXX。系列底物對(duì)硝基苯酯（p-NP）和系列脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品都購(gòu)于Sigma公司。月桂醇醚磷酸酯、十二烷基硫酸鈉（SDS）、月桂酸鈉（LAS）、吐溫80（Tween80）、聚乙二醇辛基苯基醚（TritonX-100）、乙二胺四乙酸（EDTA）、苯甲基磺酰氟（（PMSF）、Tris（三羥甲基氨基甲烷）、磷酸二氫鈉、甘氨酸、氫氧化鈉等購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，以上試劑未經(jīng)特殊指明均為分析純?cè)噭?/p>

1.2 重組質(zhì)粒

pET28a-TLL1的構(gòu)建根據(jù)大腸桿菌優(yōu)勢(shì)密碼子，對(duì)獲得的TlLipA氨基酸序列（GenbankNo.SHG68904.1）進(jìn)行密碼子優(yōu)化，優(yōu)化的TlLipA基因序列由上海捷瑞生物工程有限公司通過(guò)全基因合成。分別以NcoI和EcoRI對(duì)TlLipA基因（tll1）及pET28a進(jìn)行雙酶切反應(yīng)，酶切后將質(zhì)粒pET28a和tll1連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Top10中，經(jīng)驗(yàn)證，獲得正確的重組質(zhì)粒pET28a-TLL1。

1.3 重組脂肪酶

TlLipA酶學(xué)性質(zhì)的表征方法最適反應(yīng)溫度的測(cè)定：在45～85℃溫度范圍內(nèi)分別測(cè)定酶活力，以最高酶活力為100%計(jì);熱穩(wěn)定性的測(cè)定：將酶液于55～70℃分別保溫不同時(shí)間，測(cè)定酶活力，以初始酶活力為100%計(jì)。最適反應(yīng)pH的測(cè)定：在pH4.0～11.0范圍內(nèi)分別測(cè)定重組脂肪酶TlLipA的酶活力，以最高酶活力為100%計(jì);pH穩(wěn)定性的測(cè)定：將酶液于不同pH緩沖液中室溫（25℃）放置1h，測(cè)定酶活力，以初始酶活力為100%計(jì)。金屬離子和化學(xué)試劑對(duì)酶影響的測(cè)定：在反應(yīng)體系中加入不同的金屬離子及化學(xué)試劑至其終濃度為1mmol/L，Tween80終濃度為0.05%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)），混合保溫1h后，測(cè)定酶活力，以加入等量蒸餾水的酶樣品為對(duì)照。底物特異性的測(cè)定：測(cè)定重組脂肪酶TlLipA對(duì)不同碳鏈長(zhǎng)度對(duì)硝基苯酯（p-NP）的偏好特性。測(cè)定的底物如下：棕櫚酸對(duì)硝基苯酯（p-NPP，C16）、肉豆蔻酸對(duì)硝基苯酯（p-NPM，C14）、月桂酸對(duì)硝基苯酯（p-NPL，C12）、癸酸對(duì)硝基苯酯（p-NPD，C10）、辛酸對(duì)硝基苯酯（p-NPO，C8）、己酸對(duì)硝基苯酯（p-NPC，C6）、乙酸對(duì)硝基苯酯（p-NPA，C2）。動(dòng)力學(xué)反應(yīng)參數(shù)的測(cè)定：取不同濃度（0.1～2mmol/L）的p-NPP在最適條件下與純化的TlLipA反應(yīng)，測(cè)定酶活力，用Sigma-Plot軟件作圖，得出動(dòng)力學(xué)反應(yīng)參數(shù)。

2 微生物脂肪酶的應(yīng)用

2.1 重組GZEL酶蛋白制備

GZEL在無(wú)任何表面活性劑條件下，以三辛酸甘油酯為底物，測(cè)定不同pH條件下的脂肪酶活力。結(jié)果表明：不同pH條件下的脂肪酶活力呈典型的鐘形曲線。脂肪酶活性在pH=5.0條件下最大，為（1.48±0.07）×105U/g;以大豆來(lái)源L-α-磷脂酰膽堿為底物時(shí)，測(cè)得該酶在不同pH條件下的磷脂酶活力曲線，結(jié)果表明，在pH=6.0時(shí)表現(xiàn)出最大的磷脂酶活性，活力為3506.94±274.47U/g。在無(wú)任何表面活性劑存在條件下，脂肪酶GZEL的選擇性指數(shù)為42.2該結(jié)果與之前報(bào)道的乳化法測(cè)定所得的結(jié)果相吻合（41.57）。本文測(cè)定GZEL發(fā)揮脂肪酶活力的最適反應(yīng)pH與之前報(bào)道的以橄欖油乳化法反應(yīng)體系測(cè)得的結(jié)果有所不同（pH7.0）。這可能與反應(yīng)體系和反應(yīng)底物不同有關(guān)。在本研究中，選取了常見(jiàn)的不同類(lèi)型表面活性劑：陰離子型：N-月桂酰肌氨酸鈉、十二烷基硫酸鈉（SDS）、脫氧膽酸鈉（NaTDC）;陽(yáng)離子型：十四烷基三甲基溴化銨（TTAB）、苯扎氯銨（DDBAC）;非離子型：聚乙二醇辛基苯基醚（TritonX-100）、辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷;兩性離子型：3-（膽酰胺丙基）二甲氨基]丙磺酸內(nèi)鹽（CHAPS）、十二烷基磺丙基甜菜堿作為代表。同時(shí)每種表面活性劑參照其各自臨界膠束濃度值選取三種不同濃度（CMC）來(lái)測(cè)定不同表面活性劑濃度條件下脂肪酶GZEL在不同pH（2.0～11.0）下對(duì)應(yīng)脂肪酶活力和磷脂酶活力。

2.2 金屬離子

銅離子對(duì)不同脂肪酶的影響有著很大的不同。銅離子能夠激活NCIM3639脂肪酶的活性，但對(duì)其他絕大部分脂肪酶都產(chǎn)生抑制作用。而汞離子與鐵離子對(duì)絕大部分脂肪酶都表現(xiàn)為抑制作用。

結(jié)語(yǔ)

在微生物酶的研究?jī)?nèi)容上，篩選、基因克隆表達(dá)和酶的純化與性質(zhì)研究是主流，酶催化機(jī)理和晶體結(jié)構(gòu)解析等更深入的研究較少，蛋白質(zhì)工程改造工作也不多。酶分子改造能進(jìn)一步提高酶的工作效能，而理論研究是蛋白質(zhì)工程的重要指導(dǎo)，可以預(yù)期今后會(huì)有更多微生物酶理論研究及分子改造工作。

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