崔健昆，耿乃志，孟凡吉，施麗春，田耕，韓玉生*

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040；2.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150001)

中藥姜黃，性味辛、苦，溫，可以內(nèi)行氣血、外散風(fēng)寒，功能活血散瘀、行氣通經(jīng)、止痛消腫，長于治療胸痹、痛經(jīng)、風(fēng)濕痹痛、跌打腫瘀等。姜黃素和去甲氧基姜黃素(Demethoxycurcumin,DMC)是姜黃的主要活性成份，二者具有相近的化學(xué)結(jié)構(gòu)和相似的藥理作用。研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素對心血管損傷具有良好保護作用，臨床主要用于心力衰竭、動脈粥樣硬化、心律失常等疾病的治療[1-3]。作為姜黃素的天然衍生物， DMC對心血管的保護作用及機制的研究尚不十分明確。本研究采用(Thapsigargin，TG)誘導(dǎo)乳鼠心肌細胞建立(Endoplasmic Reticulum Stress，ERS)模型，旨在探討DMC調(diào)節(jié)GRP78和CHOP蛋白表達水平的影響及意義，為 DMC防治心血管疾病提供客觀依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

出生24～48 h的清潔級SD新生鼠由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供，許可證號：SCXK(黑)2016004。

1.2 藥品與試劑

去甲氧基姜黃素(DMC)、毒胡蘿卜素(TG)購自美國 Sigma 公司；DMEM 培養(yǎng)基、胰蛋白酶、青鏈霉素雙抗購自Gibco；胎牛血清購自杭州四季青公司；LDH、MDA和SOD檢測試劑盒購自南京建成生物工程公司； CCK-8、細胞凋亡檢測試劑盒，購自Dojindo； GADPH單抗、GRP78和CHOP多克隆抗體購自CST；蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標準，美國 MBI公司；SDS-PAGE電泳凝膠，ECL檢測試劑盒，美國 Amresco公司；PVDF 膜，美國Millipore 公司；其余試劑為國產(chǎn)分析純試劑。

1.3 儀器

酶標儀(Multiscan MK3型)，美國Thermo公司；CO培養(yǎng)箱(BC-J80S型)，上海博迅公司；超凈化工作臺(SW-CJ-2FD型)，蘇州凈化； 熒光倒置顯微鏡 (IX51型)，日本Olympus；電泳儀及轉(zhuǎn)膜儀(164-5051型)、凝膠成像系統(tǒng)(Gel Doc XR型)、流式細胞儀，美國Bio-Rad公司。

1.4 乳鼠心肌細胞培養(yǎng)及分組處理

按參考文獻[4]方法，在無菌條件下將出生24～48 h的新生鼠心尖部位的心肌組織，用無菌剪刀剪成1 mm3大小，加入一定比例的0.15%胰蛋白酶在37 ℃水浴下消化，制備成心肌細胞懸液，然后差速離心貼壁。用DMEM培養(yǎng)液(含15%胎牛血清)將細胞濃度調(diào)整為3×106個，接種于培養(yǎng)瓶中進行原代培養(yǎng)。

取原代培養(yǎng)心肌細胞，常規(guī)培養(yǎng)24 h后更換無胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h。隨機分為4組:①對照組：細胞不做任何藥物處理，常規(guī)培養(yǎng)24 h至實驗結(jié)束；②模型組：培養(yǎng)液中加入1 μmol/L TG，常規(guī)培養(yǎng)24 h，建立ERS模型；③DMC低濃度組：在培養(yǎng)液中同時加入1 μmol/L TG和10 μmol/L DMC，常規(guī)培養(yǎng)24 h； ④DMC高濃度組：在培養(yǎng)液中同時加入1 μmol/L TG和30 μmol/L DMC，常規(guī)培養(yǎng)24 h。

無菌避光環(huán)境下，將TG、DMC溶于二甲化亞砜(DMSO)中，配置成 1 mol/L的儲存液，分裝于EP 管中置于-20 ℃的冰箱中避光保存。

1.5 CCK-8 法檢測細胞活力

將心肌細胞以2×103個/孔的密度接種于96孔板中，培養(yǎng)液體積100 μL，實驗處理結(jié)束后加入10 μLCCK-8，并設(shè)立沒有細胞的對照孔，放于培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 h，酶標儀在450 nm下檢測A值。每組設(shè)6個復(fù)孔并重復(fù)3次。

1.6 細胞LDH、MDA和SOD水平檢測

調(diào)整細胞密度為1×106/mL接種于6孔板，每組設(shè)置6個復(fù)孔。收集細胞制備成勻漿，檢測 LDH、MDA和SOD 水平，嚴格按試劑盒說明書進行操作。

1.7 Western blot檢測GRP78和CHOP蛋白表達

收集細胞后加入 RIPA裂解液在冰上充分裂解，BCA試劑盒檢測蛋白濃度。調(diào)整蛋白濃度后每孔上樣量為30 μg，SDS-PAGE凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后，加入一抗、二抗孵育。ECL顯示，凝膠成像系統(tǒng)掃描并分析蛋白表達水平。

1.8 流式細胞儀檢測細胞凋亡

采用Annexin V-FITC PI雙染法檢測細胞凋亡百分率。常規(guī)培養(yǎng)各組細胞并經(jīng)干預(yù)處理后，0.2%胰酶消化處理，離心收集細胞。4 ℃的PBS洗滌后加入200 μL結(jié)合緩沖液重懸細胞，并加入 Annexin V 10 μL，流式細胞儀檢測細胞凋亡。FITC檢測：激發(fā)光波長488 nm，發(fā)射光波長515 nm；PI檢測：發(fā)射光波長560 nm。數(shù)據(jù)用Flow Jo軟件進行細胞凋亡的相對定量分析。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

2 實驗結(jié)果

2.1 DMC對TG誘導(dǎo)心肌細胞活力和細胞凋亡的影響

與對照組相比較，模型組的心肌細胞活力表現(xiàn)為明顯下降，細胞凋亡率明顯增加，P<0.05；與模型組相比，DMC給藥組心肌細胞活力均明顯增加，細胞凋亡率明顯減少，P<0.05。結(jié)果見表1、圖1。

表1 DMC對TG誘導(dǎo)心肌細胞活力和細胞凋亡的影響

圖1 DMC對TG誘導(dǎo)心肌細胞凋亡的影響

2.2 DMC對TG誘導(dǎo)心肌細胞LDH 、MDA和SOD 水平的影響

與對照組相比，模型組細胞LDH及MDA含量升高，而SOD活力則降低，P<0.05；與模型組比較，不同濃度DMC干預(yù)后，LDH及MDA含量顯著降低，SOD活力則顯著升高，P<0.05。結(jié)果見表2。

表2 DMC對TG誘導(dǎo)心肌細胞LDH、MDA和SOD水平的影響

2.3 DMC對 TG 誘導(dǎo)心肌細胞GRP78和CHOP蛋白表達的影響

與對照組相比較，模型組心肌細胞GRP78和CHOP蛋白表達升高顯著，P<0.05；與模型組相比較，不同濃度DMC干預(yù)后，GRP78和CHOP蛋白表達降低，P<0.05。表明DMC對TG誘導(dǎo)心肌細胞GRP78和CHOP蛋白表有明顯的抑制作用。結(jié)果見表3、圖2。

表3 DMC對TG誘導(dǎo)心肌細胞GRP78和CHOP蛋白表達影響

注：1.對照組；2.ERS模型組；3.DMC低劑量組；4.DMC高劑量組圖2 DMC對TG誘導(dǎo)心肌細胞GRP78和CHOP蛋白表達影響

3 討論

心肌細胞凋亡是缺血性心臟病重要的病理機制之一，通過抑制心肌細胞凋亡能夠改心臟功能，與ERS相關(guān)的細胞凋亡途徑是當(dāng)前研究熱點[5-7]。ERS主要由蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(PERK)、活化轉(zhuǎn)錄因子6(ATF6) 和肌醇酶1(IRE1) 3種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白介導(dǎo)。研究表明ERS發(fā)生與Ca2+代謝紊亂密切相關(guān)，Ca2+濃度的穩(wěn)定是調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶GRP78非常重要因素[8]。在ERS發(fā)生狀態(tài)下，GRP78的表達量呈現(xiàn)明顯增加，可以促使細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中未折疊的蛋白發(fā)生折疊，以此減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的嚴重程度[9-10]。在細胞處于長時間或者嚴重的ERS的情況下，會進一步使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中促凋亡蛋白CHOP的表達呈現(xiàn)上調(diào)，由抑制凋亡轉(zhuǎn)變?yōu)榇龠M細胞凋亡，最終引起細胞死亡[11-12]。CHOP介導(dǎo)的ERS相關(guān)凋亡參與了多種心血管疾病的發(fā)生發(fā)展[13-14]。TG是多種細胞培養(yǎng)中常用的ERS模型誘導(dǎo)劑[9-10]，通過抑制鈣泵和Mg2+-ATPase，使Ca2+大量轉(zhuǎn)運到細胞漿中，而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的Ca2+濃度下降，引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能障礙，未折疊蛋白的含量增加并大量聚集，最終導(dǎo)致ERS的發(fā)生[15-16]。

我們前期研究發(fā)現(xiàn)，DMC能夠減輕乳鼠心肌細胞缺氧/復(fù)氧所造成的細胞損害，對心肌缺血再灌注模型小鼠心肌具有明顯的保護作用，其機制與抑制細胞凋亡和自噬相關(guān)蛋白有關(guān)。本研究以TG誘導(dǎo)乳鼠心肌細胞ERS為研究對象，探討DMC是否能夠直接抑制ERS的發(fā)生及機制。通過預(yù)試驗確定1 μmol/L的TG直接刺激細胞24 h為ERS的最佳劑量和作用時間。研究結(jié)果表明，與對照組相比較，模型組細胞的活性明顯下降，細胞凋亡明顯增加，LDH及MDA含量升高，而SOD活力則降低，GRP78和CHOP蛋白表達顯著升高；與模型組比較，DMC濃度為10 μmol/L和30 μmol/L分別作用心肌細胞ERS模型24 h時，細胞活性升高，細胞凋亡明顯減少，LDH及MDA含量顯著降低，SOD活力則顯著升高，并且GRP78和CHOP蛋白表達降低。

綜上所述，TG誘導(dǎo)了心肌細胞發(fā)生ERS，GRP78、CHOP蛋白表達增加，促進了心肌細胞凋亡， DMC能夠劑量依賴性的抑制GRP78和CHOP蛋白的高表達，使PERK活化和磷酸化水平受到明顯抑制，減弱ERS時內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白質(zhì)的積聚，同時降低LDH和MDA的釋放、提升SOD酶活性，從而保護心肌細胞免于ERS損傷，可能為DMC治療心血管疾病提供新靶點。