楊玉潔，張毅偉，彭達(dá)，趙爽，張慶樂，王浩

(山東第一醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院臨床藥學(xué)教研室，泰安 271016)

抗壞血酸在治療壞血病、增強(qiáng)免疫力、預(yù)防惡性腫瘤等方面具有良好的效果[1-3]，但由于穩(wěn)定性較差，易溶于水而損失[4]，需制成緩釋制劑以保證其治療效果。與纖維素衍生物、殼聚糖和膠原等傳統(tǒng)的藥物緩釋材料相比[5]，層狀雙金屬氧化物具有特殊的層狀結(jié)構(gòu)和較大的比表面積、良好的生物相容性和穩(wěn)定性，成為極具開發(fā)潛力的新型藥物緩釋載體[6-9]。以植物提取液為軟模板合成層狀雙金屬氧化物是國際先進(jìn)合成方法，該方法利用植物提取液中含有的多酚、黃酮、還原糖和蛋白質(zhì)等生物活性成分作為還原劑和穩(wěn)定劑，在相對溫和的反應(yīng)條件下對材料的形貌結(jié)構(gòu)進(jìn)行人工調(diào)控，從而提高對目標(biāo)藥物的負(fù)載率和緩釋性能[10-12]。

樹葉來源廣泛，品種繁多，成為合成納米金屬或金屬氧化物的首選模板材料，如MACHADO等[11]利用桑樹葉、蘋果葉、檸檬葉等26種葉片提取液合成納米鐵，陳波等[12]利用紅背桂葉、桉樹葉和樟樹葉的提取液綠色合成氧化鐵。筆者在本文以松針提取液為軟模板合成鐵鋯雙金屬氧化物，探討材料的制備條件對抗壞血酸負(fù)載能力的影響；利用體外實(shí)驗(yàn)評價(jià)抗壞血酸插層鐵鋯氧化物在模擬胃液和腸液中的緩釋效果，并利用急性毒性實(shí)驗(yàn)評價(jià)該材料的生物安全性。

1 材料與儀器

1.1試驗(yàn)材料 抗壞血酸(批號：20180622，含量>99.7%)、十六烷基三甲基溴化銨(cetyltrimethylammonium bromide,CTMAB)(批號：57-09-0)、三氯化鐵(批號：7705-08-0)和氯氧化鋯(批號：13520-92-8)等均為分析純，購自南京細(xì)諾化工科技有限公司。

1.2試驗(yàn)儀器 Spectrumlab752s紫外-可見分光光度計(jì)(上海棱光技術(shù)有限公司)；HY-5A型回旋式振蕩器(江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司)；PHS-25C酸度儀(杭州奧立龍有限公司)；HH-6J數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州智博瑞儀器制造有限公司)；SHB-ⅢA循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)。

2 試驗(yàn)方法

2.1松針?biāo)嵋旱闹苽?將采摘的松針洗凈，置于60 ℃的烘箱內(nèi)干燥24 h，用粉碎機(jī)粉碎，松針粉和純化水按質(zhì)量比1：20的比例加入到蒸餾燒瓶中，80 ℃的恒溫水浴鍋加熱1 h，真空抽濾后得松針?biāo)嵋骸?/p>

2.2鐵鋯氧化物的制備 將一定量的三氯化鐵、氯氧化鋯和十六烷基三甲基溴化銨加入到盛有松針?biāo)嵋?00 mL的燒杯中，置于磁力攪拌器上連續(xù)攪拌60 min，使其混勻。0.1 mol·L-1氫氧化鈉溶液逐滴滴定，調(diào)節(jié)溶液的pH值為9.5。將燒杯封口置于80 ℃的烘箱內(nèi)陳化24 h，抽濾后將濾渣置于105 ℃下干燥24 h。殘?jiān)?00 ℃下煅燒2 h，得到鐵鋯氧化物。改變鐵鋯氧化物中鐵和鋯的含量及比例、十六烷基三甲基溴化銨的加入量、反應(yīng)溫度和烘干時(shí)間等條件制備一系列的鐵鋯氧化物。

2.3抗壞血酸負(fù)載方法 將鐵鋯氧化物0.1 g加入到盛有濃度為20 mg·L-1抗壞血酸100 mL的錐形瓶中，置于恒溫振蕩器上進(jìn)行震蕩反應(yīng)，待反應(yīng)達(dá)到平衡后，抽濾。利用紫外-可見分光光度計(jì)在波長245 nm處測定濾液的吸光度，利用下式(1)計(jì)算抗壞血酸的負(fù)載率：

R=C0-CeC0×100% (1)

式中：R為抗壞血酸負(fù)載率(%)；C0為抗壞血酸初始濃度(mg·L-1)；Ce為抗壞血酸平衡濃度(mg·L-1)。

2.4抗壞血酸緩釋量的測定 參照2010年版《中華人民共和國藥典》中方法配制人工胃液和腸液來模擬人體內(nèi)環(huán)境。利用最佳條件下合成的鐵鋯氧化物對抗壞血酸進(jìn)行負(fù)載，制備抗壞血酸插層鐵鋯氧化物復(fù)合材料。將抗壞血酸插層鐵鋯氧化物復(fù)合材料0.1 g放入盛有人工胃液和腸液20 mL錐形瓶中，置于恒溫振蕩器上進(jìn)行緩釋實(shí)驗(yàn)，分別于5，10，15，30，45，60，90，120，180，240，330和450 min取樣，測其吸光度，并計(jì)算抗壞血酸的緩釋量。

2.5急性毒性試驗(yàn) 配制濃度為9.88，14.82，22.22和33.33 mg·mL-1鐵鋯復(fù)合物的混懸液。取健康昆明種小鼠[購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物有限公司，合格證號：11400700221315，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號SCXK(京)2016-0011，實(shí)驗(yàn)動物使用許可證號：SYXK(魯)2012-0005]，雌雄各半，體質(zhì)量22～24 g，分為4組(n=6)，采用口服灌胃法一次性依次給藥，灌胃劑量以20 mL·kg-1。每天記錄小鼠的體質(zhì)量、食量變化情況，并觀察其排便情況及有無嗜睡的現(xiàn)象，連續(xù)觀察10 d，對鐵鋯復(fù)合物的急性毒性進(jìn)行初步觀察。

3 結(jié)果

3.1制備條件對抗壞血酸負(fù)載率的影響

3.1.1鐵鋯摩爾比的影響 在100 mL松針提取液、0.5 g CTMAB中，依次添加不同摩爾質(zhì)量的三氯化鐵和氯氧化鋯(摩爾比分別為8：1，4：1，1：1、1：4，1：8)，使二者的總量為0.01 mol，采用化學(xué)沉淀法合成鐵鋯氧化物，并對抗壞血酸進(jìn)行負(fù)載。由圖1可知：當(dāng)鐵鋯摩爾比為8：1時(shí)，該復(fù)合氧化物對抗壞血酸的負(fù)載率達(dá)到最大值91.76%。隨著鐵鋯摩爾比的增加，鐵鋯氧化物對抗壞血酸的負(fù)載率逐漸降低到76.11%。因此，選擇鐵鋯摩爾比為8：1時(shí)制備該復(fù)合氧化物效果較好。

圖1 鐵鋯摩爾比對抗壞血酸負(fù)載率的影響

3.1.2CTMAB加入量的影響 在100 mL松針提取液、0.01 mol三氯化鐵和氯氧化鋯(鐵鋯摩爾比為8：1)溶液中，依次加入CTMAB 0.1，0.2，0.3，0.4和0.5 g，采用化學(xué)沉淀法合成鐵鋯氧化物，并對抗壞血酸進(jìn)行負(fù)載。由圖2可知：隨著CTMAB質(zhì)量從0.1 g增加到0.5 g，鐵鋯復(fù)合物對抗壞血酸的負(fù)載率從73.73%逐漸增加到 90.31%。繼續(xù)增加CTMAB質(zhì)量，鐵鋯復(fù)合物對抗壞血酸負(fù)載率基本趨于穩(wěn)定。所以，CTMAB的適宜質(zhì)量為0.5 g。

圖2 CTMAB加入量對抗壞血酸負(fù)載率的影響

3.1.3反應(yīng)溫度的影響 燒杯中加入100 mL松針提取液、0.01 mol三氯化鐵和氯氧化鋯(摩爾比為8：1)和0.5 g CTMAB，置于溫度分別為20，40，60，80和100 ℃的磁力攪拌器上持續(xù)攪拌60 min，采用化學(xué)沉淀法合成鐵鋯氧化物，并對抗壞血酸進(jìn)行負(fù)載。由圖3可知：隨著反應(yīng)溫度的增加，鐵鋯復(fù)合物對抗壞血酸的負(fù)載率呈現(xiàn)明顯的先增加后降低的趨勢，當(dāng)反應(yīng)溫度為60 ℃時(shí)，鐵鋯復(fù)合氧化物對抗壞血酸的負(fù)載率達(dá)到最大值為96.71%。所以，鐵鋯復(fù)合物最適宜的反應(yīng)溫度為60 ℃。

圖3 反應(yīng)溫度對抗壞血酸負(fù)載率的影響

3.1.4烘干時(shí)間的影響 燒杯中分別加入松針提取液100 mL、0.01 mol三氯化鐵和氯氧化鋯(摩爾比例為8：1)和CTMAB 0.5 g，置于60 ℃的磁力攪拌器上持續(xù)攪拌60 min，改變烘干時(shí)間分別為0，1，2，4，8，12，24，36和48 h，采用化學(xué)沉淀法合成鐵鋯復(fù)合氧化物，并對抗壞血酸進(jìn)行負(fù)載。由圖4可知，當(dāng)烘干時(shí)間為0～24 h時(shí)，鐵鋯氧化物對抗壞血酸的負(fù)載率隨著烘干時(shí)間的延長從73.08%增加到97.82%，當(dāng)烘干時(shí)間36和48 h時(shí)，鐵鋯氧化物對抗壞血酸的負(fù)載率分別為97.89%和97.96%，僅有略微增加。綜合考慮藥物負(fù)載率和烘干時(shí)間，確定最適宜的烘干時(shí)間為24 h。

圖4 烘干時(shí)間對抗壞血酸負(fù)載率的影響

3.2抗壞血酸緩釋量的測定 由圖5可知，在人工胃液中，制劑中抗壞血酸的釋放量隨著時(shí)間推移逐漸增加。在0～240 min范圍內(nèi)，釋放量增速較明顯，此后增速放緩，在450 min時(shí)釋放量達(dá)到極大值73.43%。在人工腸液中，制劑中抗壞血酸的釋放量隨著時(shí)間延長逐漸增加，在0～200 min范圍內(nèi)，抗壞血酸的釋放量增速較明顯，此后增速放緩，在450 min時(shí)釋放量達(dá)到極大值63.74%?？傮w來看，不同時(shí)間內(nèi)在人工胃液中抗壞血酸的釋放量均高于人工腸液中抗壞血酸的釋放量。

圖5 抗壞血酸在模擬胃液和腸液中的緩釋量

3.3急性毒性實(shí)驗(yàn) 納米金屬氧化物在生物和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用，如氧化鐵因其良好的生物相容性和獨(dú)特的超順磁性，被用作緩釋藥物的載體材料；氧化鋯應(yīng)用于牙科和人工支架領(lǐng)域，均被證實(shí)無明顯細(xì)胞毒性和動物急性毒性[13-14]。本文鐵鋯復(fù)合氧化物合成工藝中未加入任何有毒試劑，為進(jìn)一步確證其安全性，進(jìn)行了復(fù)合物急性毒性的初步實(shí)驗(yàn)。以質(zhì)量濃度為1.976和2.964 g·kg-1的鐵鋯化合物灌胃時(shí)，小鼠體征變化均正常；以質(zhì)量濃度為4.44 g·kg-1的鐵鋯化合物灌胃時(shí)，小鼠食欲稍有下降；以質(zhì)量濃度為6.666 g·kg-1的鐵鋯化合物灌胃時(shí)，小鼠僅食欲稍有下降且短時(shí)少動，但并無死亡。根據(jù)2005年《化學(xué)藥物急性毒性試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則》最大給藥量法，給藥量>5 g·kg-1未有動物死亡，可初步推測鐵鋯化合物無明顯的急性毒性，結(jié)果見表1。但鐵鋯化合物對于機(jī)體各組織器官有無病理學(xué)損傷，還有待進(jìn)一步研究。

表1 小鼠急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

4 討論

松針提取液含有黃酮、多糖、多酚、蛋白質(zhì)、莽草酸等多種有效成分，可改變鐵鋯氧化物的形貌結(jié)構(gòu)，從而影響其對抗壞血酸的載藥率。CTMAB是一種典型的陽離子表面活性劑，可減少鐵鋯氧化物顆粒在溶液中的聚集，提高其比表面積和對抗壞血酸的載藥率。通過單一因素的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，當(dāng)三氯化鐵和氯氧化鋯的摩爾比為8：1、加入0.5 g CTMAB、反應(yīng)溫度為60 ℃、烘干時(shí)間為24 h時(shí)，合成的鐵鋯氧化物對抗壞血酸的最大負(fù)載率為97.82%。隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，抗壞血酸插層鐵鋯氧化物中的藥物向模擬胃液和腸液中逐漸釋放，從而使藥物釋放率隨時(shí)間延長而逐步增加，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為450 min時(shí)，最大釋放率分別為73.43%和 63.74%?；诩毙远拘缘膶?shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，鐵鋯氧化物并無明顯急性毒性，適宜作為抗壞血酸的緩釋材料。

5 結(jié)論

利用松針提取液為綠色溶劑合成鐵鋯氧化物具有良好的生物相容性、對抗壞血酸具有較高的載藥率和緩釋性能，是一種較好的抗壞血酸類藥物的緩釋載體。