王雪，張寶喜，胡堃，龔寧波，呂揚(yáng)

(北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院、中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所、晶型藥物研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100050)

慢性髓細(xì)胞白血病(chronic myeloid leukemia，CML)是一種世界范圍內(nèi)罕見(jiàn)的造血干細(xì)胞惡性克隆性疾病，發(fā)病率為1～2/10萬(wàn)人口，約占成人白血病的15%[1-2]。CML發(fā)病的分子基礎(chǔ)是斷裂點(diǎn)簇集區(qū)-埃希爾森小鼠白血病病毒癌基因同源物(breakpoint cluster region-Abelson murine leukemia viral oncogene homolog,BCR-ABL)融合基因編碼的蛋白具有高酪氨酸激酶活性，從而使細(xì)胞處于過(guò)度增殖且凋亡受阻的狀態(tài)[3-5]。伊馬替尼(imatinib)主要通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性抑制酪氨酸激酶活性從而有效治療CML，但仍對(duì)部分患者治療效果不佳[6]。近年來(lái)，靶向藥物聯(lián)合生物素治療腫瘤逐漸成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)[7]，國(guó)內(nèi)有研究表明伊馬替尼聯(lián)合槲皮素可協(xié)同誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[4-5，7]，具有較好的開(kāi)發(fā)潛力，但由于伊馬替尼和槲皮素的水溶性較差，導(dǎo)致其應(yīng)用受到限制。為了解決這一難題，采用制備納米制劑來(lái)改善藥物溶解性成為第一選擇。

納米藥物技術(shù)是增加難溶性藥物溶解度的有效途徑[8]。通過(guò)納米制備技術(shù)，藥物粒徑為納米級(jí)別，表面積顯著增大，藥物溶解度增加[9]。多項(xiàng)研究表明，納米包封能增加伊馬替尼對(duì)癌細(xì)胞的療效，減輕其對(duì)心臟的毒副作用[10-11]，常見(jiàn)的納米化技術(shù)主要包括反溶劑法、乳化溶劑揮發(fā)法、超臨界流體法、高壓均質(zhì)法以及噴霧干燥法等[12-13]。筆者在本研究采用加熱攪拌法，得到伊馬替尼-槲皮素的共無(wú)定型物。為提高共無(wú)定型物的溶解度，選取聚維酮K30作為穩(wěn)定劑，聯(lián)合應(yīng)用反溶劑沉淀法[14]與冷凍干燥法得到伊馬替尼-槲皮素的納米制劑，并對(duì)其進(jìn)行分析表征和飽和溶解度評(píng)價(jià)。

1 材料與儀器

1.1儀器 XS-105 型分析天平(瑞士梅特勒-托利多儀器公司，感量：0.01 mg)；FDU-1100真空冷凍干燥機(jī)(東京理化EYELA公司)；D/max-2550型粉末X射線衍射儀(日本Rigaku公司)；1/500型差示掃描量熱儀(瑞士梅特勒-托利多儀器公司)；ZetasizerNano S90型高靈敏納米粒度分析儀(英國(guó)馬爾文公司)；Spectrum400 型傅里葉紅外光譜儀(英國(guó)PerkinElmer公司)；1200型高相液相色譜儀(美國(guó)安捷倫科技有限公司)。

1.2藥品與試劑 伊馬替尼原料藥(武漢遠(yuǎn)城科技發(fā)展有限公司，批號(hào)：20190614，含量>98.0%)；二水合槲皮素原料藥(陜西慧科植物開(kāi)發(fā)有限公司，批號(hào)：20080106，含量>98.0%)；聚維酮K30(PVP K30，西安天正藥用輔料有限公司，批號(hào)：20160602，醫(yī)藥項(xiàng))；娃哈哈純凈水、甲醇、乙腈，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中所用溶劑均為色譜純。

2 方法與結(jié)果

2.1伊馬替尼-槲皮素共無(wú)定型物制備 精密稱取伊馬替尼原料藥493.6 mg，二水合槲皮素原料藥338.3 mg，溶解于甲醇溶液30 mL中，在溫度為80℃，300 r·min-1條件下加熱攪拌至全部溶解，將所得溶液趁熱過(guò)濾，濾液繼續(xù)攪拌至溶液揮干，獲得亮黃色粉末，即為摩爾比為1：1的伊馬替尼-槲皮素共無(wú)定型物樣品。

2.2伊馬替尼-槲皮素納米制劑制備 實(shí)驗(yàn)采用反溶劑沉淀法制備納米制劑。稱取PVPK30原料藥40 mg，加入純化水20 mL溶解，制成穩(wěn)定劑，將伊馬替尼-槲皮素共無(wú)定型物樣品50 mg溶于甲醇溶液5 mL中，在室溫下將穩(wěn)定劑溶液20 mL在300 r·min-1轉(zhuǎn)速下攪拌，用注射器將伊馬替尼-槲皮素共無(wú)定型物的甲醇溶液緩慢注入，繼續(xù)攪拌10 min，獲得混懸液。將混懸液濾過(guò)后，采用冷凍干燥法除去溶劑后獲得黃色粉末狀固體，即為伊馬替尼-槲皮素納米制劑。

2.3分析表征實(shí)驗(yàn)

2.3.1粉末X射線衍射分析 分別稱取伊馬替尼-槲皮素物理混合物(以下簡(jiǎn)稱物理混合物)、伊馬替尼-槲皮素共無(wú)定型物(以下簡(jiǎn)稱共無(wú)定型物)、伊馬替尼-槲皮素納米制劑(以下簡(jiǎn)稱納米制劑)各50 mg，研磨過(guò)篩后置于樣品架中，采用粉末X射線衍射儀進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)圖1(A)。共無(wú)定型物和納米制劑的粉末X射線衍射圖譜中衍射峰均為彌散峰，晶型狀態(tài)與物理混合物完全不同，表明制備產(chǎn)物中均為共無(wú)定型狀態(tài)。

2.3.2差示掃描量熱分析 采用差示掃描量熱儀對(duì)物理混合物、共無(wú)定型物、納米制劑3種樣品各2.5 mg進(jìn)行分析，獲得3種物質(zhì)的熱分析結(jié)果見(jiàn)圖1(B)。DSC曲線顯示，共無(wú)定型物和納米制劑在兩種藥物的熔點(diǎn)處均沒(méi)有吸熱峰出現(xiàn)，證實(shí)其形成了新的無(wú)定型態(tài)物質(zhì)。

2.3.3紅外光譜分析 稱取物理混合物、共無(wú)定型物、納米制劑3種樣品各5 mg，分別采用紅外光譜儀進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)圖1(C)。相比共無(wú)定型物(曲線a)和納米制劑(曲線b)，物理混合物(曲線c)中槲皮素的羥基(-OH)在3393 cm-1的伸縮振動(dòng)特征峰和伊馬替尼的氨基(-NH)在3279 cm-1的伸縮振動(dòng)特征峰均減弱或消失，提示伊馬替尼-槲皮素新共晶物質(zhì)的生成與兩個(gè)基團(tuán)形成新的弱相互作用有關(guān)。

2.4粒度分析 稱取共無(wú)定型物和納米制劑各5 mg，加純凈水稀釋后，采用納米粒度分析儀對(duì)兩者的粒徑進(jìn)行分析。粒徑分析結(jié)果見(jiàn)圖2。共無(wú)定型物平均粒徑為(1600.0±20.7)nm，分散指數(shù)(PDI)=0.158(曲線a)，納米制劑的平均粒徑為(157.3±4.5)nm，PDI=0.135(曲線b)，表明伊馬替尼-槲皮素形成納米制劑，且粒度分散均勻。

a.共無(wú)定型物；b.納米制劑；c.物理混合物。

2.5含藥量測(cè)定

2.5.1高效液相色譜法測(cè)定 伊馬替尼和槲皮素的標(biāo)準(zhǔn)曲線：分別精密稱取伊馬替尼和槲皮素原料藥各50 mg，置于50 mL量瓶，加入甲醇溶解并定容，制成伊馬替尼和槲皮素儲(chǔ)備液。精密量取一定量的儲(chǔ)備液，加入甲醇稀釋配制成濃度分別為1，5，10，25，50，100，200，500，800，1000 μg·mL-1的伊馬替尼和槲皮素系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。選用流動(dòng)相為乙腈和0.2%的磷酸水溶液梯度洗脫10 min，檢測(cè)波長(zhǎng)為272 nm，流速為1 mL·min-1，進(jìn)樣量為10 μL。色譜圖見(jiàn)圖3，伊馬替尼和槲皮素的峰形對(duì)稱性較好，無(wú)拖尾現(xiàn)象，出峰時(shí)間分別為3.635和8.773 min。記錄出峰時(shí)間和峰面積，分別以伊馬替尼和槲皮素的濃度(C，μg·mL-1)為橫坐標(biāo)，峰面積(A)為縱坐標(biāo)得到兩種原料藥的標(biāo)準(zhǔn)曲線。伊馬替尼的線性回歸方程為A=14.329C+104.64，R2=0.999 1(n=10)，槲皮素的線性回歸方程為A=15.823C+202.11，R2=0.999 2(n=10)。兩者均具有良好的線性關(guān)系，可以用于藥物含藥量的測(cè)定和溶解度實(shí)驗(yàn)分析。

2.5.2納米制劑含藥量的測(cè)定 精密稱取納米制劑5 mg，加甲醇定容至1 mL，采用HPLC法測(cè)定藥物的峰面積，結(jié)果見(jiàn)表1。經(jīng)過(guò)3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)測(cè)得納米制劑中伊馬替尼的含藥量為20.21%，槲皮素的含藥量為3.53%。其中含藥量D(%)通過(guò)公式(1)計(jì)算獲得[15]。

表1 納米制劑中伊馬替尼和槲皮素的含藥量

D(%)=m(伊馬替尼或槲皮素)m總×100%(1)

2.6飽和溶解度的測(cè)定 分別稱取伊馬替尼原料藥、槲皮素原料藥、共無(wú)定型物和納米制劑各30 mg，加入水5 mL，超聲溶解20 min后制成過(guò)飽和溶液，置于溫度37 ℃的恒溫振蕩箱中，以100 r·min-1的轉(zhuǎn)速振蕩12 h，將得到的溶液用孔徑0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)后，采用HPLC法進(jìn)行分析，分析方法與測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)所用方法一致，結(jié)果見(jiàn)表2，納米制劑中伊馬替尼的飽和溶解度為524.3 μg·mL-1，槲皮素的飽和溶解度為113.3 μg·mL-1；共無(wú)定型物中伊馬替尼的飽和溶解度為38.7 μg·mL-1，未檢測(cè)到槲皮素；伊馬替尼原料藥的飽和溶解度為60.1 μg·mL-1，槲皮素原料藥未檢測(cè)到色譜峰。分析結(jié)果顯示，納米制劑中伊馬替尼的飽和溶解度相比共無(wú)定型物和原料藥均有顯著提高，分別提高13.5倍和8.7倍；納米制劑中槲皮素的飽和溶解度也有明顯改善。

表2 納米制劑、共無(wú)定型物以及原料藥的飽和溶解度

a.共無(wú)定型物；b.納米制劑。

A.伊馬替尼；B.槲皮素。

3 討論

本文采用加熱攪拌法成功制備獲得伊馬替尼-槲皮素的共無(wú)定型物，為兩者聯(lián)合應(yīng)用提供共晶物質(zhì)基礎(chǔ)；同時(shí)在獲得新的共晶物質(zhì)狀態(tài)基礎(chǔ)上，采用反溶劑沉淀法和冷凍干燥法成功制備獲得納米制劑。與其他伊馬替尼-槲皮素的納米制劑[16]比較，本研究通過(guò)冷凍干燥法獲得納米制劑，更能保證物質(zhì)的納米狀態(tài)，從而使伊馬替尼和槲皮素的含藥量均有顯著提高；與共無(wú)定型物以及原料藥比較，本研究所得納米制劑具有粒徑小、分布均勻、飽和溶解度大等優(yōu)勢(shì)；與單一成分伊馬替尼或槲皮素納米制劑相比，作為共晶物質(zhì)，該納米制劑中槲皮素可與伊馬替尼協(xié)同誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[4-5]，在改善藥物理化性質(zhì)和共晶藥物開(kāi)發(fā)等方面具有良好的應(yīng)用開(kāi)發(fā)前景。研究結(jié)果為抗腫瘤藥物的共晶物質(zhì)探索開(kāi)發(fā)和改善成藥性研究提供了新思路。