段 豪， 徐建華， 王紫陽， 郭金博， 於朝廣， 楊 穎

〔江蘇省中國科學(xué)院植物研究所(南京中山植物園) 江蘇省落羽杉屬樹木種質(zhì)創(chuàng)新與繁育工程研究中心， 江蘇 南京 210014〕

落羽杉屬(TaxodiumRich.)包含落羽杉〔T.distichum(Linn.) Rich.〕、池杉〔T.distichumvar.imbricatum(Nuttall) Croom〕和墨西哥落羽杉(T.mucronatumTenore)3個類群[1]58-60。江蘇省中國科學(xué)院植物研究所經(jīng)過數(shù)十年的雜交選育，從落羽杉屬種間雜交后代中選育出‘中山杉’(T. ‘Zhongshanshan’)系列優(yōu)良無性系品種，該品種具有耐水濕、耐鹽堿和觀賞價值高等優(yōu)點，是長江中下游地區(qū)主要的生態(tài)和園林樹種之一[2-5]。

由于在育種過程中高頻率使用少數(shù)骨干親本，部分‘中山杉’品種的親緣關(guān)系較近，形態(tài)特征差異較小，難以鑒別，為此研究者們利用形態(tài)和分子特征對‘中山杉’系列品種的親緣關(guān)系進行了研究。楊美凌等[6]利用外部形態(tài)性狀的差異，通過聚類分析僅能理清落羽杉屬部分種類、栽培品種及雜種間的親緣關(guān)系，且表型特征易受環(huán)境因子的影響。李涵等[7]利用RAPD分子標記對落羽杉屬種類及其雜交后代共13個樣本進行親緣關(guān)系鑒定，但RAPD分子標記提供的是顯性標記，無法區(qū)分純合型和雜合型，獲得的遺傳信息不全面。隨著‘中山杉’新優(yōu)品種的推廣，在生產(chǎn)過程中難以避免出現(xiàn)品種混雜的現(xiàn)象，亟需應(yīng)用鑒別率更高的技術(shù)進行種質(zhì)鑒定。

與其他分子標記相比，SSR分子標記具有多態(tài)性高、共顯性、種屬間通用性良好等優(yōu)點，且實驗過程中所需樣本量少、操作簡便、分辨率高、可重復(fù)性強、結(jié)果穩(wěn)定， SSR分子標記已廣泛用于遺傳圖譜構(gòu)建、基因定位、指紋圖譜分析以及多樣性評價等領(lǐng)域[8]。而基于SSR分子標記的指紋圖譜也被應(yīng)用于茶樹〔Camelliasinensis(Linn.) Kuntze〕[9]和馬尾松(PinusmassonianaLambert)[10]等林木種質(zhì)資源和品種的鑒定。王紫陽等[3]利用聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)，通過81對SSR引物和6對SRAP引物組合對23個‘中山杉’品種及其親本的基因型進行分析，構(gòu)建了落羽杉屬種質(zhì)的指紋圖譜，并從中篩選出7對SSR多態(tài)性引物，對供試樣本的鑒別率達84.6%。相比于常規(guī)的聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)，熒光標記毛細管電泳技術(shù)是一項高通量、自動化的電泳技術(shù)，其分辨率約1 bp[11]，檢測結(jié)果更為精確、靈敏、高效，適用于大批量樣本的檢測分析。

為探索熒光標記毛細管電泳技術(shù)在落羽杉屬種質(zhì)鑒定中的應(yīng)用，作者基于前期篩選的SSR分子標記，采用熒光標記毛細管電泳技術(shù)對96個樣本(40個‘中山杉’系列品種以及15個池杉、23個墨西哥落羽杉和18個落羽杉的單株)進行檢測，并比較了引物的多態(tài)性以及供試樣本間的遺傳參數(shù)。考慮實際應(yīng)用時的簡便性和鑒別率，盡可能選擇數(shù)量少的引物構(gòu)建指紋圖譜；并根據(jù)供試樣本的遺傳距離進行聚類分析，探討供試樣本間的親緣關(guān)系。以期為‘中山杉’品種創(chuàng)新和推廣以及落羽杉屬種質(zhì)資源的引種和鑒定奠定基礎(chǔ)，并為‘中山杉’新品種的知識產(chǎn)權(quán)保護、優(yōu)良親本的選育和育種策略的制定提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試96個樣本具有不同的基因型，均來源于江蘇省中國科學(xué)院植物研究所落羽杉屬林木種質(zhì)資源庫，具體包括40個‘中山杉’系列品種(無性系，下同)以及15個池杉、23個墨西哥落羽杉和18個落羽杉的單株。

40個‘中山杉’系列品種包括：‘中山杉401’(‘Zhongshanshan 401’)由池杉與墨西哥落羽杉(前為父本、后為母本，下同)雜交獲得；‘中山杉1’(‘Zhongshanshan 1’)、‘中山杉27’(‘Zhongshanshan 27’)、‘中山杉86’(‘Zhongshanshan 86’)、‘中山杉91’(‘Zhongshanshan 91’)、‘中山杉102’(‘Zhongshanshan 102’)、‘中山杉118’(‘Zhongshanshan 118’)、‘中山杉123’(‘Zhongshanshan 123’)、‘中山杉140’(‘Zhongshanshan 140’)、‘中山杉146’(‘Zhongshanshan 146’)和‘中山杉149’(‘Zhongshanshan 149’)由‘中山杉302’ (‘Zhongshanshan 302’)與墨西哥落羽杉雜交獲得；‘中山杉111’(‘Zhongshanshan 111’)、‘中山杉112’(‘Zhongshanshan 112’)、‘中山杉113’(‘Zhongshanshan 113’)、‘中山杉120’(‘Zhongshanshan 120’)、‘中山杉125’(‘Zhongshanshan 125’)和‘中山杉127’(‘Zhongshanshan 127’)由墨西哥落羽杉與池杉雜交獲得；‘中山杉301’(‘Zhongshanshan 301’)、‘中山杉302’、‘中山杉1002’(‘Zhongshanshan 1002’)、‘中山杉1013’(‘Zhongshanshan 1013’)、‘中山杉1073’(‘Zhongshanshan 1073’)、‘中山杉1074’(‘Zhongshanshan 1074’)、‘中山杉1075’(‘Zhongshanshan 1075’)、‘中山杉1076’(‘Zhongshanshan 1076’)、‘中山杉1201’(‘Zhongshanshan 1201’)和‘中山杉1213’(‘Zhongshanshan 1213’)由落羽杉與墨西哥落羽杉雜交獲得；‘中山杉405’(‘Zhongshanshan 405’)、‘中山杉406’(‘Zhongshanshan 406’)、‘中山杉407’(‘Zhongshanshan 407’)、‘中山杉502’(‘Zhongshanshan 502’)、‘中山杉503’(‘Zhongshanshan 503’)、‘中山杉601’(‘Zhongshanshan 601’)和‘中山杉703’(‘Zhongshanshan 703’)由墨西哥落羽杉與落羽杉雜交獲得；‘中山杉1301’(‘Zhongshanshan 1301’)、‘中山杉1302’(‘Zhongshanshan 1302’)和‘中山杉1303’(‘Zhongshanshan 1303’)由‘中山杉102’與墨西哥落羽杉雜交獲得；‘中山杉1304’(‘Zhongshanshan 1304’)由‘中山杉302’與落羽杉雜交獲得；‘中山杉1305’(‘Zhongshanshan 1305’)和‘中山杉1306’(‘Zhongshanshan 1306’)由‘中山杉102’與落羽杉雜交獲得。

15個池杉單株中，C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9和CT引自南京中山植物園盲人植物園，ZM6、ZM8、ZM10和ZM12引自南京中山植物園樹木園，CC引自美國。23個墨西哥落羽杉單株中，YJM引自南京挹江門，DD引自南京東南大學(xué)校園，A1、A2、A3、A4、A5、XM1、XM2、XM3、XM4、XM5、XM6、XM7、XM8、JM1、JM2、JM3、JM4和JM5引自美國，B4、B6和B7引自墨西哥。18個落羽杉單株中，L1、L2、L4和L5引自河南，L7、L8、L9、LP1和LP2引自南京中山植物園，L11、L13、L14、L15、L16、L17、CL、LH1和LH2引自美國。

于2019年4月，分別在各單株的東、南、西、北4個方向采集側(cè)枝嫩芽10～15枚，放入自封袋中，用冰盒帶回實驗室，于-80 ℃冰箱中保存、備用。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 取200 mg嫩芽，用新型快速植物基因組DNA提取試劑盒(北京百泰克生物技術(shù)有限公司)提取DNA，用Berthold Colibri超微量分光光度計(德國Berthold Technology公司)檢測DNA的濃度和純度，用雙蒸水將DNA質(zhì)量濃度稀釋至5～10 ng·μL-1，置于-20 ℃冰箱中保存、備用。

1.2.2 PCR擴增 參照文獻[3]合成6對SSR引物TA0158、TA0231、TA0236、TA0438、TA0440和TA0443，在每對引物的正向引物5′端加FAM熒光標記，由上海捷瑞生物工程有限公司合成熒光引物。

用EDC-810 PCR儀(北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司)進行PCR擴增反應(yīng)。擴增體系包括10×buffer 1.50 μL、2.5 mmol·L-1dNTPs 0.30 μL、25 mmol·L-1MgCl21.50 μL、5 ng·L-1DNA樣品1.00 μL、TaqDNA聚合酶0.30 μL以及10 μmol·L-1正向和反向引物各0.15 μL，用雙蒸水補足至15.00 μL。擴增程序為：94 ℃預(yù)變性 3 min；94 ℃變性15 s、55 ℃退火15 s、72 ℃延伸30 s，共35個循環(huán)；72 ℃延伸3 min。擴增產(chǎn)物置于4 ℃保存。

1.2.3 毛細管電泳檢測 擴增產(chǎn)物先經(jīng)質(zhì)量體積分數(shù)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，然后將擴增產(chǎn)物稀釋10倍，并與ROX 500內(nèi)標(上海捷瑞生物工程有限公司)混勻；混合物經(jīng)95 ℃變性5 min后迅速冰浴3 min，用3730XL基因測序儀(美國ABI公司)進行毛細管電泳檢測[12]。

1.3 數(shù)據(jù)處理和分析

對SSR熒光標記條帶進行分析，統(tǒng)計每對引物的所有多態(tài)性位點；某一位點上有條帶記為“1”，無條帶記為“0”，形成6對引物的“0”、“1”矩陣，據(jù)此構(gòu)建供試96個樣本的SSR分子標記指紋圖譜。

采用PIC-CALC 2.0軟件計算各引物的多態(tài)性信息含量指數(shù)(PIC)；基于各引物擴增的多態(tài)性條帶，采用PopGene32軟件計算供試96個樣本的Nei’s基因多樣性指數(shù)(H)、Shannon’s多態(tài)性信息指數(shù)(I)、觀測雜合度(Ho)和期望雜合度(He)。

參照文獻[13]計算供試的‘中山杉’系列品種間以及池杉、墨西哥落羽杉和落羽杉單株間的Nei’s遺傳一致度和Nei’s遺傳距離；并將供試96個樣本的Nei’s遺傳距離矩陣導(dǎo)入MEGA 5.0軟件，構(gòu)建NJ聚類圖。

2 結(jié)果和分析

2.1 SSR分子標記的多態(tài)性分析和指紋圖譜構(gòu)建

2.1.1 多態(tài)性分析 基于6對SSR引物的多態(tài)性條帶數(shù)量計算供試樣本間的遺傳多樣性參數(shù)，結(jié)果見表1。由表1可見：6對SSR引物共檢測到48個等位基因，平均每對引物擴增出8個等位基因；共檢測到條帶91條，每對引物的擴增條帶數(shù)為9～31，平均值為15.2，其中，引物TA0158擴增的條帶數(shù)最多(31)，引物TA0231和TA0438擴增的條帶數(shù)較少(9)。6對引物的多態(tài)性條帶數(shù)為6～27，多態(tài)性條帶數(shù)總數(shù)為68；每對引物擴增的多態(tài)性條帶數(shù)平均值為11.3；多態(tài)性條帶百分率平均值為70.9%。各引物的多態(tài)性信息含量指數(shù)為0.476～0.793，平均值為0.658。

由表1還可見：供試96個樣本的Nei’s基因多樣性指數(shù)為0.690～0.843，平均值為0.755；Shannon’s多態(tài)性信息指數(shù)為1.391～2.088，平均值為1.599；觀測雜合度為0.071～0.714，平均值為0.381；期望雜合度為0.157～0.310，平均值為0.245。

表1 6對SSR引物擴增條帶的多態(tài)性及供試落羽杉屬樣本間的遺傳多樣性參數(shù)Table 1 Polymorphism of amplified bands of 6 pairs of SSR primers and genetic diversity parameter among test samples of Taxodium Rich.

2.1.2 指紋圖譜 依據(jù)SSR分子標記分析結(jié)果， 40個‘中山杉’系列品種的SSR指紋圖譜見表2； 15個池杉、23個墨西哥落羽杉和18個落羽杉單株的SSR指紋圖譜見表3。

表2 基于SSR引物TA0158、TA0236、TA0440和TA0443擴增條帶構(gòu)建的‘中山杉’系列品種的指紋圖譜Table 2 Fingerprints of Taxodium ‘Zhongshanshan’ series cultivars constructed based on amplified bands of SSR primer TA0158， TA0236，TA0440 and TA0443

表3 基于SSR引物TA0158、TA0231、TA0236、TA0438、TA0440和TA0443擴增條帶構(gòu)建的池杉、墨西哥落羽杉和落羽杉單株的指紋圖譜Table 3 Fingerprints of individuals of Taxodium distichum var. imbricatum (Nuttall) Croom， T. mucronatum Tenore and T. distichum (Linn.) Rich. constructed based on amplified bands of SSR primer TA0158， TA0231， TA0236，TA0438，TA0440 and TA0443

由表2可見：運用4對SSR引物TA0158、TA0236、TA0440和TA0443的擴增條帶就可以構(gòu)建40個‘中山杉’系列品種的指紋圖譜，指紋編碼數(shù)量為33，鑒別率達85.0%，這4對SSR引物可作為鑒定‘中山杉’系列品種的核心引物。除‘中山杉111’與‘中山杉123’、‘中山杉407’與‘中山杉503’、‘中山杉1074’與‘中山杉1021’的指紋圖譜分別相同外，通過該SSR指紋圖譜可鑒別其他34個‘中山杉’系列品種。

由表3可見：運用6對SSR引物TA0158、TA0231、TA0236、TA0438、TA0440和TA0443的擴增條帶可以構(gòu)建15個池杉、23個墨西哥落羽杉和18個落羽杉共56個單株的指紋圖譜，指紋編碼數(shù)量為49，鑒別率達91.1%。除墨西哥落羽杉單株A2、A4與B4以及墨西哥落羽杉單株JM2與JM3的指紋圖譜分別相同外，通過該SSR指紋圖譜可鑒別其他51個單株。

2.2 遺傳關(guān)系和聚類分析

2.2.1 遺傳關(guān)系分析 對供試的‘中山杉’系列品種以及池杉、墨西哥落羽杉和落羽杉單株的Nei’s遺傳一致度和Nei’s遺傳距離進行計算，結(jié)果顯示：‘中山杉’系列品種與池杉、墨西哥落羽杉和落羽杉的Nei’s遺傳一致度分別為0.699、0.893和0.871，Nei’s遺傳距離分別為0.358、0.114和0.137，表明‘中山杉’系列品種與墨西哥落羽杉和落羽杉的遺傳關(guān)系較近，而與池杉的遺傳關(guān)系較遠。在池杉、墨西哥落羽杉和落羽杉間，池杉與墨西哥落羽杉和落羽杉的Nei’s遺傳一致度分別為0.657和0.845，Nei’s遺傳距離分別為0.420和0.169；落羽杉與墨西哥落羽杉的Nei’s遺傳一致度為0.857，Nei’s遺傳距離為0.154，表明池杉與落羽杉的遺傳關(guān)系較近，而與墨西哥落羽杉的遺傳關(guān)系較遠。

2.2.2 聚類分析 根據(jù)Nei’s遺傳距離對供試的96個樣本進行聚類分析，結(jié)果見圖1。結(jié)果顯示：在Nei’s遺傳距離0.405處，96個樣本首先被分為2大類，其中，除C6、C7和ZM6外的其他12個池杉單株聚為Ⅰ大類，其余84個樣本聚為Ⅱ大類。在Nei’s遺傳距離0.310處，Ⅱ大類可進一步分為5組，其中，‘中山杉1302’、落羽杉單株L15和‘中山杉1305’分別單獨成組，即Ⅱ1、Ⅱ2和Ⅱ3組；‘中山杉1304’、‘中山杉112’、‘中山杉149’、9個落羽杉單株和1個池杉單株聚為Ⅱ4組；其余68個樣本聚為Ⅱ5組，其中供試的23個墨西哥落羽杉單株均被聚在此組中。

大多數(shù)池杉單株聚為一大類，而落羽杉和墨西哥落羽杉的所有單株與‘中山杉’系列品種聚為另一大類，說明池杉與供試‘中山杉’系列品種的遺傳關(guān)系較遠，而落羽杉和墨西哥落羽杉則與供試‘中山杉’系列品種的遺傳關(guān)系較近，特別是墨西哥落羽杉，與大多數(shù)‘中山杉’系列品種的遺傳關(guān)系更近。

3 討論和結(jié)論

基于聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)技術(shù)，王紫陽等[3]利用7對SSR引物構(gòu)建26個落羽杉屬樣本的指紋圖譜，鑒別率為84.6%。本研究采用熒光標記毛細管電泳技術(shù)，利用其中4對SSR引物建立的40個‘中山杉’系列品種的指紋圖譜，鑒別率達85.0%；而利用6對SSR引物建立的池杉、墨西哥落羽杉和落羽杉的56個單株的指紋圖譜，鑒別率可達91.1%，說明相較于PAGE技術(shù)，熒光標記毛細管電泳技術(shù)具有較高的分辨率。

王紫陽等[3]的研究結(jié)果顯示：6對SSR引物TA0158、TA0231、TA0236、TA0438、TA0440和TA0443擴增條帶的多態(tài)性信息含量指數(shù)(PIC)分別為0.514、0.362、0.677、0.488、0.393和0.420，平均值為0.476。而本研究中，同樣6對SSR引物的PIC值分別為0.793、0.666、0.626、0.476、0.764和0.625，平均值為0.658，各引物的PIC值明顯提高。PIC值越高，表明SSR分子標記的多態(tài)性越豐富[14]。若PIC<0.25，表示引物具有低度多態(tài)性；若0.250.50，則表示引物具有高度多態(tài)性[15]?？梢?，利用熒光標記毛細管電泳檢測技術(shù)可以顯著提高同一SSR引物擴增條帶的多態(tài)性。

SSR分子標記通常是共顯性標記，呈共顯性的引物有3種帶型，即只有父本帶、只有母本帶和親本雜合帶[16-17]。本研究中，針對‘中山杉’系列品種進行SSR分子標記擴增，在排除信息錯誤后，其中有些品種的擴增條帶出現(xiàn)了親本中沒有的新條帶，例如：經(jīng)四堿基(CCTT)5重復(fù)SSR引物TA0443擴增后，‘中山杉1002’出現(xiàn)2條長度分別為182和190 bp的條帶，而其父本落羽杉單株L4僅有1條長度為182 bp的條帶，母本墨西哥落羽杉單株DD出現(xiàn)2條長度分別為182和186 bp的條帶，從中可以看出‘中山杉1002’出現(xiàn)的長度為190 bp的條帶是其雙親本均沒有的新條帶。在鴨茅(DactylisglomerataLinn.)[18]和茄(SolanummelongenaLinn.)[19]的SSR分子標記擴增條帶中也存在這一現(xiàn)象，這種情況可能是由于在配子體形成過程中，染色體減數(shù)分裂時同源染色體發(fā)生配對與交換，染色體復(fù)制過程中存在堿基突變等現(xiàn)象，從而表現(xiàn)出DNA條帶的消失或新條帶的出現(xiàn)[18-19]。

： 池杉單株 Individuals of Taxodium distichum var. imbricatum(Nuttall) Croom； ： 墨西哥落羽杉單株Individuals of T. mucronatum Tenore； ： 落羽杉單株Individuals of T. distichum (Linn.) Rich.圖1 40個‘中山杉’系列品種以及56個池杉、墨西哥落羽杉和落羽杉單株的NJ聚類圖Fig. 1 NJ dentrogram of 40 cultivars of Taxodium ‘Zhongshanshan’ series and 56 individuals of T. distichum var. imbricatum (Nuttall) Croom， T. mucronatum Tenore and T. distichum (Linn.) Rich.

在供試的40個‘中山杉’系列品種中，僅少數(shù)品種以池杉為親本雜交獲得，所有品種均是以墨西哥落羽杉或墨西哥落羽杉的雜交后代為親本雜交或回交后獲得的品種，因而在NJ聚類圖上，大多數(shù)池杉單株聚為一大類，所有墨西哥落羽杉單株與所有‘中山杉’系列品種被聚在另一大類中，說明墨西哥落羽杉單株與 ‘中山杉’系列品種有較近的遺傳關(guān)系。由此可見，SSR分子標記可在一定程度上追溯‘中山杉’系列品種與其親本間的親緣關(guān)系。

從19世紀至今，對落羽杉屬下類群的分類處理一直存在爭議[20]。本研究中，從供試的池杉、墨西哥落羽杉和落羽杉單株的Nei’s遺傳距離看，池杉與落羽杉的遺傳關(guān)系更近，與Lickey等[21]基于形態(tài)學(xué)證據(jù)對這2個類群遺傳關(guān)系的研究結(jié)果一致，印證了將池杉作為落羽杉變種[1]59的分類處理。從上述的聚類圖可見：部分‘中山杉’系列品種與其父本關(guān)系更近(如‘中山杉302’與其父本落羽杉)，部分‘中山杉’系列品種與其母本關(guān)系更近(如‘中山杉401’與其母本墨西哥落羽杉)，還有部分‘中山杉’系列品種難以判斷與親本的關(guān)系(如‘中山杉1002’)；雖然大多數(shù)池杉單株聚為一類，落羽杉和墨西哥落羽杉單株以及全部的‘中山杉’系列品種聚為另一大類，但還有少數(shù)池杉單株與落羽杉和墨西哥落羽杉單株有較近的Nei’s遺傳距離，導(dǎo)致這一現(xiàn)象的原因可能是這3個類群的原分布區(qū)域互相重疊，可產(chǎn)生自然雜交的后代。

植物不同種間雜交或基因滲透在自然界非常普遍，如松屬(PinusLinn.)種類間存在的基因滲透現(xiàn)象[22]。落羽杉屬的種類可能也存在類似現(xiàn)象，如：McMillan[23]在美國德克薩斯州墨西哥落羽杉與落羽杉的重疊分布區(qū)域，觀察到大量的具有二者中間特征和結(jié)實種子的后代；Lickey等[24]在研究中也發(fā)現(xiàn)了大量池杉和落羽杉的中間類型個體。落羽杉屬種類通過這種自然雜交過程產(chǎn)生的基因交換，使各種類的遺傳多樣性水平提高，且‘中山杉’系列品種在育種過程中反復(fù)雜交和回交也使不同品種的遺傳多樣性水平存在較大差異，如供試96個樣本的Nei’s基因多樣性指數(shù)和Shannon’s多態(tài)性信息指數(shù)分別為0.690～0.843和1.391～2.088，平均值分別達到0.755和1.599，為‘中山杉’系列品種的改良奠定了豐富的遺傳基礎(chǔ)。

綜合分析結(jié)果表明：供試96個樣本的遺傳多樣性較高，依據(jù)SSR分子標記構(gòu)建的40個‘中山杉’系列品種以及落羽杉屬3個類群56個單株的指紋圖譜，對供試樣本的鑒別率分別達到85.0%和91.1%，因而，可以采用毛細管電泳技術(shù)并運用SSR分子標記構(gòu)建落羽杉種質(zhì)資源的指紋圖譜。此外，通過聚類分析，發(fā)現(xiàn)供試的部分‘中山杉’系列品種及其親本間的遺傳關(guān)系較為混亂，因而，在后續(xù)的還應(yīng)進一步借助多學(xué)科手段對落羽杉屬的種質(zhì)資源進行鑒定。