鄒俊丞，盧占軍，喬 寧，饒 敏，鄺 敏，鐘延文，黃雪媛

1. 贛南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江西 贛州 341000 2. 贛州海關(guān)，江西 贛州 341000 3. 國(guó)家臍橙工程技術(shù)研究中心，江西 贛州 341000

引 言

柑橘黃龍病是世界柑橘產(chǎn)業(yè)面臨的最具危險(xiǎn)性的病害，致病機(jī)制還不清楚，目前尚無(wú)有效的藥物可以治療，俗稱“柑橘癌癥”[1]，國(guó)際上美國(guó)、 巴西、 澳大利亞等柑橘主產(chǎn)國(guó)都面臨著柑橘黃龍病的威脅。在我國(guó)，柑橘黃龍病已經(jīng)遍布福建、 廣東、 廣西、 海南柑橘產(chǎn)區(qū)全境，在浙江、 江西、 湖南等十余個(gè)省、 區(qū)均有報(bào)道，并且逐年向北擴(kuò)散[2]。由于尚無(wú)有效的治療藥物，因此對(duì)于該病主要以防控為主，及時(shí)發(fā)現(xiàn)病樹(shù)以采取砍樹(shù)等措施是防治黃龍病的關(guān)鍵，實(shí)驗(yàn)室診斷方法由于檢測(cè)周期長(zhǎng)、 成本高等原因而實(shí)用性不強(qiáng)，田間病樹(shù)判定方法主要是觀察癥狀[3]，受個(gè)人經(jīng)驗(yàn)與主觀影響，尤其是在沒(méi)有特異性癥狀的情況下，結(jié)果不可靠，導(dǎo)致果農(nóng)質(zhì)疑阻撓。

近紅外光譜技術(shù)對(duì)柑橘黃龍病的田間檢測(cè)應(yīng)用已有報(bào)道，劉燕德[4]證實(shí)了近紅外檢測(cè)技術(shù)在柑橘黃龍病診斷方面的可行性，饒敏[5]等研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)采集柑橘樹(shù)葉光譜數(shù)據(jù)并建模，可以在田間實(shí)現(xiàn)快速、 無(wú)損檢測(cè)。柑橘黃龍病常發(fā)生于韌皮部[6-7]，病菌在樹(shù)葉和樹(shù)皮中都能全年檢測(cè)到[8]，但目前的黃龍病近紅外檢測(cè)研究?jī)H局限于以樹(shù)葉為樣本。

以樹(shù)皮為樣本或有利于黃龍病的早期發(fā)現(xiàn)。由于黃龍病影響營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)移、 吸收與分布，整棵果樹(shù)的各個(gè)部位(尤其是運(yùn)送營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的樹(shù)皮韌皮部)都受到疾病的影響，也都包含了特異的生化信息[9]。另外，佛羅里達(dá)大學(xué)的研究認(rèn)為，柑橘黃龍病菌進(jìn)入樹(shù)葉后，先迅速向下傳播到根部，在根部增殖并破壞根系后，又迅速向上擴(kuò)散到其他部位，當(dāng)葉片癥狀出現(xiàn)時(shí)，其根系早已嚴(yán)重受損[10]，因此，樹(shù)皮韌皮部作為病菌及特異性營(yíng)養(yǎng)組分運(yùn)送、 堵塞的主干道，能夠在疾病的早期階段提供特異信息，更有助于疾病的早期診斷，減少黃龍病防控的被動(dòng)性。

關(guān)于有機(jī)體的近紅外光譜技術(shù)應(yīng)用，越來(lái)越多學(xué)者開(kāi)始綜合運(yùn)用多個(gè)部位、 多個(gè)組織的光譜信息：有研究發(fā)現(xiàn)，從西瓜、 蘋果的不同部位采集光譜對(duì)最終的近紅外模型檢測(cè)精度有影響。譚峰等通過(guò)研究水稻稻瘟病的近紅外光譜數(shù)據(jù)，建議將莖、 葉、 籽粒差異性最強(qiáng)的波段相結(jié)合進(jìn)行分析，更有利于疾病診斷。

黃龍病病菌在柑橘樹(shù)體內(nèi)的分布規(guī)律尚不明確，綜合多部位的光譜信息將有利于黃龍病的陽(yáng)性檢出率。Johnson等[10]發(fā)現(xiàn)根部病原菌含量更高，而Ding等[11]發(fā)現(xiàn)葉柄病原菌含量最高、 根部含量最低，兩者結(jié)論相反。而且同一棵樹(shù)的不同部位組織，黃龍病病菌含量差異明顯[12]。本研究以樹(shù)葉、 樹(shù)皮韌皮部作為樣本，探討不同采樣部位柑橘黃龍病近紅外快速預(yù)測(cè)模型的差異，旨在選擇合適的采樣方案，進(jìn)一步優(yōu)化近紅外技術(shù)在柑橘黃龍病檢測(cè)方面的應(yīng)用。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 采樣方法與試驗(yàn)材料

樹(shù)皮采樣：目前尚無(wú)關(guān)于樹(shù)皮韌皮部采樣的報(bào)道，本文自主研發(fā)樹(shù)皮韌皮部采樣辦法，即定制標(biāo)準(zhǔn)化樹(shù)皮剝皮器，確保所有樹(shù)皮樣品寬度一致。取樹(shù)皮樣品12條，寬度均為0.5 cm，平均長(zhǎng)度為11.34 cm，如圖1。為了確保樹(shù)皮采樣不影響果樹(shù)生長(zhǎng)，以果樹(shù)四個(gè)方向的側(cè)枝為采樣部位。

圖1 定制標(biāo)準(zhǔn)化剝皮器及所得樹(shù)皮Fig.1 The standardized stripper and obtained bark

樹(shù)葉采樣：取東西南北四個(gè)方向的冠層樹(shù)葉，所有樣本編號(hào)后，用采樣袋密封保存于4 ℃。

實(shí)驗(yàn)用臍橙樹(shù)葉及樹(shù)皮取樣于國(guó)家臍橙工程技術(shù)研究中心的溫室和臍橙種植基地，所有樹(shù)均為2011年種植的紐荷爾臍橙，并通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)法確認(rèn)黃龍病染病情況。共采集染病樹(shù)葉樣本365份、 染病樹(shù)韌皮部樣本226份、 健康樹(shù)葉樣本228份、 健康韌皮部樣品291份，合計(jì)1110份樣品。

表1中樣品數(shù)為0的部分，系所采集的樣品未能及時(shí)(24 h內(nèi))掃描光譜數(shù)據(jù)，樣品因品質(zhì)降低而作廢。有報(bào)道，樣品量大于91，81，70的近紅外模型，其模型精度沒(méi)有顯著改變。本實(shí)驗(yàn)各組樣品量在151～243之間，雖然各組樣品量不是完全一致，但是，都大于最小樣品量要求，不會(huì)對(duì)模型精度產(chǎn)生顯著影響。

表1 采樣數(shù)量一覽表Table 1 The table of sampling number

1.2 儀器及裝置

光譜采集裝置由臺(tái)式電腦、 IRTracer 100 NIR光譜儀組成，光譜分析儀為傅立葉近紅外光譜系統(tǒng)，采用InGaAs檢測(cè)器，光譜范圍12 500～350 cm-1，光譜分辨率0.25 cm-1，光譜精度0.05 cm-1，光譜準(zhǔn)確度0.1 cm-1。

1.3 光譜采集

光譜掃描設(shè)定的參數(shù)分辨率為8 cm-1時(shí)，掃描速度為5張光譜/秒。采用其自帶的LabSolutions IR軟件進(jìn)行光譜采集，樹(shù)葉或樹(shù)皮樣品覆蓋于檢測(cè)器的鏡頭上方，為了避免外界光源的影響，用儀器自帶的擋光蓋覆蓋于樣本上方。為避免取樣部位對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響，光譜掃描點(diǎn)分布如圖2。

圖2 光譜掃描點(diǎn)Fig.2 Scan points for the spectrum

1.4 光譜與數(shù)據(jù)分析

1.4.1 原始光譜分析

D=D-Leaf+D-Bark

1.4.2 校正集和預(yù)測(cè)集

有研究報(bào)道，用極大線性無(wú)關(guān)的方法選擇代表性樣品作為校正集，發(fā)現(xiàn)其預(yù)測(cè)效果比隨機(jī)選擇法更穩(wěn)定、 更好。本實(shí)驗(yàn)用Metlab軟件求出校正集如表2，總校正集合計(jì)740個(gè)樣本，其中樹(shù)葉樣本校正集395個(gè)，樹(shù)皮韌皮部樣本校正集345個(gè)；總預(yù)測(cè)集合計(jì)370個(gè)樣本，其中樹(shù)葉樣本預(yù)測(cè)集198個(gè)，樹(shù)皮韌皮部樣本預(yù)測(cè)集172個(gè)。

表2 校正集與預(yù)測(cè)集樣品數(shù)量Table 2 The number of calibration samples and prediction samples

1.4.3 數(shù)據(jù)預(yù)處理

采用Unscrambler 10軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，為了消除儀器、 環(huán)境條件、 樣品背景及其他因素的影響，盡可能減少譜圖基線平移、 漂移、 高頻隨機(jī)噪音等現(xiàn)象，分別采用歸一化法(normalization)、 標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)分布法(SNV)、 多元散射校正法(MSC)、 1階導(dǎo)數(shù)法(first derivative)和2階導(dǎo)數(shù)法(second derivative)對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理，再用同一種方法建模，對(duì)比各自的模型效果。

1.4.4 模型建立與模型評(píng)價(jià)

分別采用Unscrambler 10軟件中偏最小二乘回歸法(PLSR)和主成分回歸法(PCR)建立模型，并通過(guò)對(duì)比模型的校正集決定系數(shù)R2、 校正均方根誤差(RMSEC)、 預(yù)測(cè)集決定系數(shù)r2和預(yù)測(cè)均方根誤差(RMSEP)進(jìn)行模型性能評(píng)價(jià)。R2和r2越大越好，而RMSEC和RMSEP越小越好。

2 結(jié)果與討論

2.1 原始光譜圖比較

從圖3可以看出，從樹(shù)葉與樹(shù)皮韌皮面采集到的光譜峰形和波峰位置的趨勢(shì)相似，峰值出現(xiàn)在6 900 cm-1附近和5 100 cm-1附近，說(shuō)明獲取的果樹(shù)樣本光譜具有一定的特征性。并且，染病樣本與健康樣本的光譜圖無(wú)明顯差異，無(wú)法通過(guò)肉眼進(jìn)行區(qū)分。

圖3 樹(shù)葉和樹(shù)皮的原始光譜圖Fig.3 The original spectrum of leaves and barks

從圖4可以看出：一是D≈D-Bark

圖4 光譜差值圖Fig.4 D-value of the spectrum

2.2 數(shù)據(jù)預(yù)處理

將所有樹(shù)皮樣本的光譜數(shù)據(jù)用5種方法進(jìn)行預(yù)處理，所得模型預(yù)測(cè)結(jié)果如表3所示：數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)歸一化法處理后，雖然決定系數(shù)有所降低，但是依然保持在0.90以上，并且均方根誤差顯著降低(比其他三組都要小1 000倍左右)。綜合兩個(gè)指標(biāo)考慮，歸一化法(normalization)處理后的模型預(yù)測(cè)能力最好，校正集決定系數(shù)R2為0.939 0，校正集均方根誤差RMSEC為2.039 7×10-5，預(yù)測(cè)集決定系數(shù)r2為0.941 4，預(yù)測(cè)集均方根誤差RMSEP為1.889 0×10-5。

表3 不同預(yù)處理后建立PCR模型的預(yù)測(cè)結(jié)果Table 3 Predictive results of PCR models with different pre-processing methods

采用歸一化法進(jìn)行預(yù)處理之后，分別再用PLSR和PCR方法建立三種校正模型：綜合模型，是基于所有樹(shù)葉和樹(shù)皮校正集數(shù)據(jù)建立的模型；樹(shù)葉模型，是基于所有樹(shù)葉校正集數(shù)據(jù)建立的模型；樹(shù)皮模型，是基于所有樹(shù)皮校正集數(shù)據(jù)建立的模型。用預(yù)測(cè)集對(duì)各模型進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果如表4所示。

表4 臍橙不同部位采集光譜建模預(yù)測(cè)結(jié)果Table 4 Modeling using different spectra collected at different position of Navel oranges by PLSR and PCR methods

3 結(jié) 論

在近紅外光譜應(yīng)用方面，有機(jī)生物體的疾病診斷與單純化合物的成分判別有本質(zhì)的區(qū)別：

首先，在標(biāo)準(zhǔn)樣品的選擇方面，一份代表性的單純化合物就可以作為標(biāo)準(zhǔn)樣品，而有機(jī)生物體以果樹(shù)為例，一棵樹(shù)才是一份標(biāo)準(zhǔn)樣品，因?yàn)樗纳畔⑹求w現(xiàn)在樹(shù)葉、 樹(shù)干、 樹(shù)根等各個(gè)部位，僅僅以樹(shù)葉為樣本將會(huì)丟失大量的生化信息，而如果能綜合整個(gè)生命體的生化信息，將大大提高疾病診斷的準(zhǔn)確率；

其次，在模型建立方面，有機(jī)生物體的生化信息比單純化合物更復(fù)雜，而且受年齡、 品種、 疾病階段、 患病部位、 生長(zhǎng)環(huán)境、 其他疾病等等因素影響，大量的生化信息都能綜合反映到近紅外光譜中，對(duì)于近紅外數(shù)據(jù)處理與模型建立產(chǎn)生的挑戰(zhàn)，是單純化合物所不能比擬的。

3.1 原始光譜分析

本研究初步比較了染病果樹(shù)與健康果樹(shù)的近紅外原始光譜，發(fā)現(xiàn)與健康果樹(shù)相比，染病果樹(shù)的樹(shù)葉、 樹(shù)皮之間的吸光度差值減小。有可能是果樹(shù)染病后，導(dǎo)致植株體內(nèi)某些特異性組分發(fā)生定向轉(zhuǎn)移(或本該轉(zhuǎn)移而未轉(zhuǎn)移)，導(dǎo)致樹(shù)葉與樹(shù)皮的近紅外光譜發(fā)生互動(dòng)性改變，下一步，應(yīng)當(dāng)以整棵果樹(shù)為個(gè)體，探索染病后的果樹(shù)，樹(shù)葉、 樹(shù)皮近紅外光譜的綜合性變化，為柑橘黃龍病的近紅外光譜診斷提供線索。

另外，本研究也發(fā)現(xiàn)染病樹(shù)皮的吸光度大于健康樹(shù)皮，而樹(shù)葉的吸光度則未有明顯變化。推測(cè)有可能是因?yàn)辄S龍病導(dǎo)致樹(shù)體營(yíng)養(yǎng)成分運(yùn)輸不暢，樹(shù)皮韌皮部的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)堆積，進(jìn)而導(dǎo)致吸光度增高。

3.2 不同采樣方案的模型對(duì)比

分別用樹(shù)葉光譜數(shù)據(jù)、 樹(shù)皮韌皮部光譜數(shù)據(jù)、 “樹(shù)葉+樹(shù)皮”光譜數(shù)據(jù)建立近紅外檢測(cè)模型并對(duì)比其精度和相關(guān)性，模型預(yù)測(cè)結(jié)果表明：

(1) 三種模型精度都較高(RMSEP在10-5量級(jí))，說(shuō)明三種采樣方式建立黃龍病近紅外光譜檢測(cè)模型都具有可行性，但三種模型的相關(guān)系數(shù)偏高(r2)，存在過(guò)擬合的可能，將會(huì)降低模型的兼容性，需要進(jìn)一步做降維處理。

(2) 樹(shù)葉的組分比樹(shù)皮韌皮部的組分更復(fù)雜，但以樹(shù)葉光譜數(shù)據(jù)建立的模型誤差卻更小，一方面有可能是因?yàn)闃?shù)葉中的黃龍病特異生化信息更豐富，另一方面有可能是因?yàn)闅w一化法等數(shù)據(jù)方法足以消除非特異性組分的信息干擾。

(3) 三種采樣方式所得模型精度依次降低，而決定系數(shù)卻依次升高，這說(shuō)明僅以樹(shù)葉光譜數(shù)據(jù)建模，雖然精度較好，但數(shù)據(jù)擬合度不如樹(shù)皮韌皮部光譜模型。因此，在實(shí)際應(yīng)用中，為提高模型的數(shù)據(jù)擬合度，一方面可以采用常規(guī)辦法，即增加樹(shù)葉樣本數(shù)量，另一方面，當(dāng)樹(shù)葉樣本量有限時(shí)，或增加樹(shù)葉樣本量的效果不顯著時(shí)，也可以綜合樹(shù)皮韌皮部光譜數(shù)據(jù)。

(4) 本研究中第三種采樣建模方案是參考了全局校正模型的思路，將樹(shù)葉和樹(shù)皮的光譜數(shù)據(jù)放到一個(gè)校正集中建立模型，這種全局模型效果并沒(méi)有顯著優(yōu)于單一樣本類型的模型效果，有可能是因?yàn)闃?shù)葉和樹(shù)皮的基本屬性不同，不能通過(guò)全局校正的方式進(jìn)行簡(jiǎn)單整合。