陳乃東

皖西學(xué)院生物與制藥工程學(xué)院，安徽 六安 237012

引 言

霍山石斛(DendrobiumhuoshanenseC. Z. Tang et S. J. Cheng)為蘭科石斛屬植物、 安徽道地藥材[1-2]，具有滋陰養(yǎng)胃、 清熱生津、 潤肺止咳之功效；含多糖[3-6]、 生物堿等[7-8]，具有增強(qiáng)免疫、 明目、 延緩衰老等多種功效[9-11]。近年來，由于需求增加，導(dǎo)致以霍山石斛為代表的石斛類藥材價(jià)格急劇上升。作為石斛資源綜合利用的一部分，將石斛的鮮花干制成花茶，作為保健飲料日漸為市場接受。然而，由于產(chǎn)量、 口感與藥理活性的差異，不同來源的石斛花茶，價(jià)格差異顯著，其中以霍山石斛花茶價(jià)格最高，市場價(jià)近3 000～5 000元·kg-1。在經(jīng)濟(jì)利益驅(qū)使下，市場上以價(jià)格較低的鐵皮石斛(DendrobiumofficinaleKimura et Migo.)、 河南石斛(DendrobiumhenanenseJ. L. Lu et L. X Gao)[2]花茶冒充霍山石斛花茶時(shí)有發(fā)生，急需構(gòu)建霍山石斛花茶與鐵皮石斛、 河南石斛花茶鑒定方法。

作為親緣關(guān)系相近的石斛屬植物，霍山石斛與鐵皮石斛、 河南石斛鮮花的形態(tài)相近[2]，形態(tài)學(xué)上主要區(qū)別在于鐵皮石斛與河南石斛花的唇瓣有一紫色斑塊，而霍山石斛花的唇瓣白色、 無斑塊[圖1(a,b,c)]。當(dāng)加工成花茶后，鐵皮石斛與河南石斛花唇瓣上的紫色斑塊消失[圖1(d,e,f)]，極大提高了鑒別難度。

圖1 霍山石斛(a, d)、 鐵皮石斛(b, e)、 河南石斛(c, f)花及其花茶Fig.1 The flowers and the flower tea of D. huoshanense (a, d), D. officinale (b, e) and D. henanense (c, f)

中藥材粉末的紅外光譜具有一定的“指紋”性，借助紅外特征吸收譜圖的差異可達(dá)到區(qū)分和鑒別中藥材的目的。將包括一維紅外光譜(ATR-FTIR譜)、 二階導(dǎo)數(shù)光譜(SD-IR譜)、 二維紅外光譜(2D COS IR譜)的多級(jí)紅外光譜技術(shù)，用于中藥材的真?zhèn)舞b定及其質(zhì)量控制，可極大提升紅外光譜區(qū)分復(fù)雜樣品間細(xì)微差別的能力[12]。有鑒于此，本實(shí)驗(yàn)擬采用多級(jí)紅外光譜技術(shù)，建立三種石斛花茶基于ATR-FTIR譜、 SD-IR譜以及溫度微擾2D COS IR譜的多級(jí)紅外指紋圖譜，探討霍山石斛花茶與鐵皮石斛、 河南石斛花茶的區(qū)別，構(gòu)建快速、 高效的霍山石斛、 鐵皮石斛、 河南石斛花茶多級(jí)紅外鑒定方法，為霍山石斛花茶真?zhèn)舞b定與質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 樣品

實(shí)驗(yàn)材料霍山石斛、 鐵皮石斛與河南石斛花茶于2018年7月購自霍山、 金寨不同的花茶生產(chǎn)企業(yè)不同批次加工的花茶(表1)。103 ℃紅外烘箱烘干至恒重，粉碎，過40目篩，備用。

表1 石斛花茶樣品Table 1 The Dendrobium flower tea samples

1.2 儀器

傅里葉變換紅外光譜儀Nicolet iS50(美國熱電)、 YGH-500S/BS紅外烘箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司)、 FA-1004型電子分析天平(上海精科天平廠)等。

1.3 數(shù)據(jù)采集

精密稱取1.1節(jié)制備的霍山石斛、 鐵皮石斛、 河南石斛花茶供試品粉末，在4 000～400 cm-1范圍內(nèi)采集ATR-FTIR紅外光譜，間隔4 cm-1，每個(gè)樣品累積掃描16次。然后將不同石斛花茶樣品裝入變溫附件，溫度從60 ℃逐步升高至120 ℃，每升15 ℃采集一次ATR-FTIR紅外光譜。每個(gè)樣品重復(fù)采集三次光譜，取平均值。實(shí)驗(yàn)設(shè)5個(gè)重復(fù)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用儀器自帶的OMNIC分析軟件，對(duì)采集的ATR-FTIR譜，進(jìn)行光滑處理、 自動(dòng)基線校正、 縱坐標(biāo)歸一化處理后，對(duì)每一個(gè)樣品的五個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)測定結(jié)果取平均譜，作為該樣品ATR-FTIR標(biāo)準(zhǔn)譜。從軟件中導(dǎo)出峰位、 峰強(qiáng)等信息，對(duì)比分析確定三種石斛花茶的ATR-FTIR特征峰。

利用OMNIC軟件對(duì)三種石斛花茶的平均ATR-FTIR譜進(jìn)行二階導(dǎo)數(shù)轉(zhuǎn)換獲SD-IR譜，對(duì)比分析三種石斛花茶SD-IR譜差異。

基于三種石斛花茶的平均ATR-FTIR光譜及其經(jīng)過數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化獲得的SD-IR光譜，利用OMNIC軟件對(duì)不同地區(qū)、 不同廠家、 不同生產(chǎn)批次的石斛花茶進(jìn)行相似度對(duì)比研究。

將1.3節(jié)采集的溫度微擾下的紅外譜進(jìn)行自動(dòng)光滑、 自動(dòng)基線校正、 縱坐標(biāo)歸一化等處理后，利用OMNIC軟件中的Spectra Corr二維相關(guān)分析軟件處理，獲得溫度動(dòng)態(tài)譜即溫度微擾2D COS IR譜。分析對(duì)比確定三種石斛花茶二維紅外光譜存在穩(wěn)定差別區(qū)域，分析在該區(qū)域里三種供試品的自動(dòng)峰的峰位、 峰強(qiáng)，相關(guān)峰的峰位及其正、 負(fù)性。

1.5 方法學(xué)考察

1.5.1 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

按1.3節(jié)所述方法，隨機(jī)取1.1節(jié)制備供試品1.0 g，每隔2 h采集1次ATR-FTIR譜，連續(xù)測定6次，利用OMNIC中相似度分析軟件分析6次采集的ATR-FTIR譜相似度均大于99%，提示結(jié)果在12 h之內(nèi)基本穩(wěn)定。

1.5.2 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)

按1.3節(jié)所述方法，隨機(jī)取1.1節(jié)制備霍山石斛花茶供試品6份，每份1.0 g，測其ATR-FTIR譜，用OMNIC中相似度分析軟件分析其ATR-FTIR譜的相似度均大于99%；繼續(xù)按1.3節(jié)所述方法，獲得2D COS IR譜，收集6個(gè)樣品的自動(dòng)峰峰位、 峰強(qiáng)，以及相關(guān)峰的峰位、 峰強(qiáng)、 正/負(fù)相關(guān)性等數(shù)據(jù)，運(yùn)用SPSS軟件進(jìn)行相關(guān)性分析，6份供試品2D COS IR譜相關(guān)系數(shù)均大于0.99，表明該方法具有較好的重現(xiàn)性。

1.5.3 精密度實(shí)驗(yàn)

從1.1節(jié)制備供試品隨機(jī)取一樣品，按1.3節(jié)所述方法，重復(fù)采集5次光譜，將5個(gè)光譜進(jìn)行相似度分析，相似度均大于0.99，表明儀器精密度良好。

1.6 外部驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

三種石斛花茶第四批樣品DHS25-34，DHN25-34，DO25-34，按1.3節(jié)所述方法，采集數(shù)據(jù)，按1.4節(jié)所述方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

采用基于前三批樣品構(gòu)建的三種石斛花茶鑒定特征，鑒定第四批樣品的花茶種類。

2 結(jié)果與討論

2.1 霍山石斛、 鐵皮石斛與河南石斛花茶ATR-FTIR譜分析

霍山石斛、 鐵皮石斛與河南石斛花茶的ATR-FTIR譜(圖2)非常類似，很難從譜線看出三者的區(qū)別?；谌N石斛花茶平均ATR-FTIR譜的相似度分析顯示(表2)，三種石斛花茶相似度為83.1%～89.7%，提示三種石斛花茶化學(xué)成分存在差異。來自霍山、 金寨不同批次的霍山石斛花茶之間的相似度分別為99.1%～99.5%，98.7%～99.1%；來自霍山、 金寨不同批次的鐵皮石斛花茶相似度分別為98.1%～98.6%，98.6%～99%；來自霍山、 金寨不同批次的河南石斛花茶相似度分別為97.6%～98.3，97.9%～98.2%，說明產(chǎn)地和批次對(duì)三種石斛花茶的品質(zhì)影響較小。分析各樣品ATR-FTIR譜峰位、 峰強(qiáng)等數(shù)據(jù)后發(fā)現(xiàn)，霍山石斛花茶在1 398 cm-1有穩(wěn)定的特征峰，鐵皮石斛花茶在1 542 cm-1有穩(wěn)定的特征峰，河南石斛花茶在603，703，811，1 332和1 610 cm-1等波數(shù)處有特征峰，根據(jù)這些ATR-FTIR譜的特征峰，可以初步鑒別三種石斛花茶。

表2 不同石斛花茶基于ATR-FTIR光譜的相似度對(duì)比結(jié)果Table 3 The similarity coefficients of the 3 kinds of flower tea based on their ATR-FTIR spectrum (%)

圖2 三種石斛花茶的ATR-FTIR譜(4 000～400 cm-1)a: 霍山石斛；b: 鐵皮石斛；c: 河南石斛Fig.2 The ATR-FTIR spectra of the 3 kinds of Dendrobium flower tea in the range of 4 000～400 cm-1a: D. huoshanense；b: D. officinale；c: D. henanense

2.2 霍山石斛、 鐵皮石斛與河南石斛花茶的SD-IR譜分析

基于三種石斛花茶SD-IR譜的相似度分析(表3)可見，三種石斛花茶相似度為70.9%～87.9%，明顯低于基于ATR-FTIR譜的相似度，提示二階導(dǎo)數(shù)處理能明顯的提高光譜分辨率，一定程度上增加光譜靈敏度。金寨的霍山石斛、 鐵皮石斛與河南石斛花茶不同批次間相似度依次為：92.9%～93.9%，90.0%～91.0%，90.9%～93.2%，霍山的霍山石斛、 鐵皮石斛與河南石斛花茶不同批次間相似度依次為：92.0%～93.2%，90.3%～93.8%，91.8%～94.6%，進(jìn)一步證明不同產(chǎn)地和批次的霍山石斛、 鐵皮石斛與河南石斛花茶品質(zhì)相對(duì)穩(wěn)定。三種石斛花茶在1 800～600 cm-1的SD-IR譜(圖3)上，可以觀察到明顯差異：在1 750～1 690 cm-1區(qū)間，相對(duì)鐵皮石斛與河南石斛，霍山石斛花茶SD-IR譜呈明顯“M”形；在1 140～1 080 cm-1區(qū)間，霍山石斛與河南石斛SD-IR譜呈深“W”型，鐵皮石斛呈不規(guī)則形；在1 000～930 cm-1區(qū)間，霍山石斛花茶SD-IR譜為“M” 形，鐵皮石斛與河南石斛花茶呈“W”形。SD-IR譜能更好地分辨ATR-FTIR譜圖中的重疊峰，根據(jù)三種石斛花茶的SD-IR譜在上述波段的差異，可直接區(qū)分霍山石斛花與鐵皮石斛花、 河南石斛花茶。

圖3 三種石斛花茶SD-IR譜(1 800～600 cm-1)a: 霍山石斛；b: 鐵皮石斛；c: 河南石斛Fig.3 The SD-IR spectra of the 3 kinds of Dendrobium flower tea in the range of 1 800～600 cm-1a: D. huoshanense；b: D. officinale；c: D. henanense

表3 不同石斛花茶基于SD-FTIR光譜的相似度對(duì)比結(jié)果Table 3 The similarity coefficients of the 3 kinds of flower tea based on their SD-FTIR spectrum (%)

2.3 山石斛、 鐵皮石斛與河南石斛花茶的2D COS IR譜鑒別

圖4 三種石斛樣品的2D COS IR譜(1 230～1 130 cm-1)(a): 霍山石斛花茶; (b): 鐵皮石斛花茶; (c) 河南石斛花茶Fig.4 The synchronous 2DCOS-IR contour plot of different Dendrium samples in the region of 1 230～1 130 cm-1(a): D. huoshanese；(b): D. officinale；(c): D. henanese

表4 三種石斛樣品的自動(dòng)峰及強(qiáng)度Table 4 The auto peaks and their relative intensity on 2D COS IR spectra among the 3 Dendrobium samples. (intensity value: ×10-4)

因此，與ATR-FTIR譜、 SD-IR譜相比，溫度微擾2D COS IR譜可顯著放大不同石斛花茶樣品間差別，表觀分辨率明顯提高，使得形態(tài)學(xué)極為相似的霍山石斛、 鐵皮石斛與河南石斛花茶很容易區(qū)分，可為其鑒別提供可靠依據(jù)。在本實(shí)驗(yàn)條件下，根據(jù)1 230～1 130 cm-1波數(shù)范圍內(nèi)2D COS IR譜相關(guān)峰的個(gè)數(shù)、 位置、 強(qiáng)度以及交叉峰的位置、 正負(fù)，可以區(qū)分霍山石斛、 鐵皮石斛與河南石斛花茶。

2.4 外部驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

通過對(duì)比分析，在第四批樣品中，均檢測出基于前三批樣品發(fā)現(xiàn)的ATR-FTIR特征峰、 在SD-IR光譜上觀察到三種花茶的特異峰型、 在1 230～1 130 cm-1波數(shù)范圍內(nèi)2D COS IR譜相關(guān)峰，表明本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的多維紅外光譜鑒定方法具有良好的穩(wěn)定性。此外，與近紅外光譜鑒定相比，本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的多維紅外光譜方法中的SD-IR譜和溫度微擾2D COS IR譜，可以提供直觀的、 可視的鑒別特征，可為中藥真?zhèn)舞b定提供候選方法。

3 結(jié) 論

采用多級(jí)紅外光譜法，對(duì)霍山石斛花茶與鐵皮石斛、 河南石斛茶進(jìn)行了比較，結(jié)果表明采用ATR-FTIR譜、 SD-IR譜和溫度微擾2D COS IR譜相結(jié)合的多級(jí)紅外光譜分析方法，可以快速、 準(zhǔn)確區(qū)別霍山石斛花茶及其常見偽品——鐵皮石斛花茶、 河南石斛花茶。本方法雖然存在需要較為專業(yè)的儀器設(shè)備及數(shù)據(jù)處理復(fù)雜等缺點(diǎn)，但藥材用量少、 操作簡單、 檢測時(shí)間短、 重現(xiàn)性好，結(jié)果穩(wěn)定可靠，可為石斛花茶及其他中藥材的快速真?zhèn)舞b定提供方法，為霍山石斛花茶的品質(zhì)控制提供思路與參考依據(jù)。