滕淵潔，韋其真，劉文涵，劉江美，聶永惠，李 盼

浙江工業(yè)大學化學工程學院，綠色化學合成技術國家重點實驗室培育基地，浙江 杭州 310032

引 言

農藥及殘留主要有有機磷、 有機氯、 菊酯和氨基甲酸酯四大類，同類分子在結構上具有一定的相似性，這給特定分析檢測帶來一定的困難。目前，國標[1]規(guī)定的農藥檢測方法主要有氣相色譜-質譜聯(lián)用(GC-MS)和液相色譜-質譜聯(lián)用(LC-MS)等。在色質聯(lián)用中，雖然QuEChERS法[2]可簡化前處理過程，30 min約可處理6個樣品，但色譜分離仍需較長時間，無法滿足現場大批量檢測需求。至于市場上農藥殘留的快速檢測，雖然有酶標儀、 顯色卡、 電化學速測儀等形式，但檢測原理均基于乙酰膽堿酯酶抑制法[3]，即利用農藥對乙酰膽堿酯酶的活性抑制來間接判斷是否存在農藥，但幾乎每種農藥均對乙酰膽堿酯酶有抑制作用，因此存在專一性不高的問題。從而，有必要開發(fā)一種能夠實現特異性的快速檢測農藥殘留分子的方法。

適配體(Aptamer)[4]是指一類經過篩選，能夠特異性結合靶向物質的單鏈DNA或者RNA。目前，aptamer在分子檢測領域已經發(fā)展形成了多種分析手段[5]，如比色法、 熒光法、 電化學法、 拉曼光譜法等，主要用于檢測蛋白、 微生物、 生物毒素、 有機污染物、 重金屬離子。近年來，陽性克隆篩選方法(SLECTIVE)及活性改造[6]越來越成熟，但利用aptamer方法進行農藥特效性檢測相對較少。目前，已報道具有aptamer特異性的農藥分子有啶蟲脒[7]、 莠去津、 馬拉硫磷, 丙溴磷[8]及同時檢測甲拌磷、 丙溴磷、 水胺硫磷和氧(化)樂果的aptamer[9]等；但利用aptamer建立的特效性分析方法報道較少，僅見比色法[10-11]、 電化學阻抗法[12]、 表面增強拉曼光譜法(surface-enhanced Raman scattering，SERS)等。

選擇帶負電荷的聚丙烯酸鈉作為表面帶負電荷的銀溶膠的分散劑，制備了具有良好穩(wěn)定性和分散性的SERS基底材料。再通過選擇帶有正電荷的精胺分子先行中和含磷酸骨架的aptamer上的負電荷，三氫-吲哚菁類(Cy3)染料分子標記的aptamer (Cy3-aptamer)更易吸附于帶負電荷的銀溶膠表面，而產生較強的SERS光譜。且Cy3-aptamer產生的拉曼強度的變化與啶蟲脒濃度存在一定的關系，從而實現了特異性檢測啶蟲脒分子的目的。同時為SERS法利用aptamer特異性快速檢測農藥分子提供了強有力的實驗基礎和理論依據。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

LabRAM HR UV 800激光顯微拉曼光譜儀(法國HORIBA JOBIN YVON公司)，激發(fā)光源：632.81 nm He-Ne激光器；共焦孔徑300 μm，光柵線刻數為600 line·mm-1，物鏡：50倍長焦距鏡頭。

啶蟲脒(分析標準品，aladdin)；aptamer啶蟲脒：5’-TGTAATTTGTCTGCAGCGGTTCTTGATCGCTGACACCA-TATTATGAAGA-3’ (生工生物工程(上海)股份有限公司，平均分子量15 170.81)；Cy3-aptamer：5’-Cy3-TGTAATTTGTCTGCAGCGGTTCTTGATCGCTGACACCATA-TTATGAAGA-3’ (生工生物工程(上海)股份有限公司，平均分子量15 598.34)。聚丙烯酸鈉(平均分子量5 100)、 精胺(98%)、 AgNO3為化學純。HNO3、 NaCl、 Na3C6H5O7·2H2O、 KCl、 NaH2PO4·2H2O、 NaOH、 無水Na2SO4、 Na2HPO4·12H2O等均為分析純。HCl和H2SO4為優(yōu)級純。pH 7.4磷酸緩沖溶液(0.2 mol·L-1)由NaH2PO4·2H2O和Na2HPO4·12H2O混合配制而成，并含有0.1 mol·L-1的KCl。水為18.3 MΩ·cm超純水，由UP900型超純水器(韓國HUMAN公司)制得。

Aptamer啶蟲脒使用液的配制：移取 21 μL磷酸緩沖溶液，加入到含31.7 μg Aptamer啶蟲脒的試劑盒中，搖勻得0.1 mmol·L-1的Aptamer啶蟲脒儲備液，再將其逐級稀釋成1 μmol·L-1的標準工作溶液。同法配制Cy3-aptamer的使用液。

1.2 銀溶膠合成及保存

根據Lee和Meisel的方法[13]，稱取18 mg AgNO3，溶解于100 mL水中。加熱至沸，緩慢加入新配制的1%檸檬酸鈉3.0 mL。劇烈攪拌下繼續(xù)沸騰10 min，直到溶液顏色變?yōu)榛疑?。冷卻至室溫，取15 mL銀溶膠，分別加入0.3 mL不同濃度的聚丙烯酸鈉溶液，使合成的銀納米粒子分散在聚丙烯酸鈉中以進行穩(wěn)定性試驗選擇。聚丙烯酸鈉的濃度為0.05%保存效果最佳，裝入棕色瓶于4 ℃保存，至少可以保存60 d。

1.3 聚沉劑影響考察

取500 μL 0.01%聚丙烯酸鈉的銀溶膠，500 μL 80 mmol·L-1不同的聚沉劑(NaCl，KCl，NaOH，HNO3，H3PO4，H2SO4，HCl)和500 μL 4.886×10-4mol·L-1啶蟲脒溶液混合均勻，室溫下靜置10 min，比較不同聚沉劑條件下啶蟲脒的拉曼增強信號。

1.4 方法

Cy3-aptamer與精胺“顯色”反應：取0.1 mol·L-1精胺5 μL，1 μmol·L-1Cy3-aptamer 100 μL，分別反應5，10和15 min，再加100 μL銀溶膠和5 μL 0.16 mol·L-1聚沉劑，混勻后測定拉曼信號，選擇精胺與Cy3-aptamer反應的最佳時間。

Cy3-aptamer檢測啶蟲脒并用精胺“顯色”反應：取100 μL 1 μmol·L-1Cy3-aptamer，100 μL 0.5 mmol·L-1啶蟲脒溶液，分別反應5，10，20和30 min，再加入0.1 mol·L-1精胺5 μL，反應5 min，再加入100 μL銀溶膠、 5 μL 0.16 mol·L-1聚沉劑，混勻，分別測定其拉曼信號并比較，確定Cy3-aptamer和啶蟲脒反應的最佳時間。

測定方法：取100 μL 1 μmol·L-1Cy3-aptamer，100 μL 0.25, 0.1, 0.075, 0.05, 0.01 μmol·L-1啶蟲脒溶液，反應20 min，再加入0.1 mol·L-1精胺5 μL，反應5 min，隨后加入100 μL銀溶膠、 5 μL 0.16 mol·L-1聚沉劑，混勻。樣品置于顯微激光拉曼光譜儀的物鏡視野下，調焦后進行增強拉曼光譜測試，焦點聚焦于溶液表面。掃描范圍200～3 800 cm-1，光譜采集時間60 s，積分2次平均。

2 結果與討論

2.1 Cy3-aptamer-農藥/精胺-銀溶膠SERS特異性檢測農藥原理設計

利用aptamer對特定農藥的特異性作用，以達到分離富集和特效選擇的目的。經多次試驗探索建立了測試方法：由于aptamer本身只有較弱的SERS信號，特將拉曼信號探針Cy3先與aptamer結合生成Cy3-aptamer，在精胺存在的情況下能在銀溶膠表面產生很好的SERS信號。當測定農藥時，先將Cy3-aptamer與測試液反應，此時亦不能產生SERS信號，只有加入輔助劑精胺后才能測得較強的SERS信號；當有特定農藥存在時，SERS信號會發(fā)生減弱?？梢岳貌煌腶ptamer制備不同的Cy3-aptamer，同時利用不同的農藥具有不同的拉曼譜峰可以達到進一步選擇性測定的目的；采用不同的aptamer可以達到有針對性的測定特定的農藥，最終達到針對性強的農藥測定方法。

采用對農藥啶蟲脒具有一定特異性的aptamer，并通過特殊制備將Cy3標記進入aptamer，其SERS檢測原理如圖1。

圖1 Cy3-aptamer用于SERS檢測農藥啶蟲脒示意圖Fig.1 Schematic diagram of Cy3-aptamer applied in the specific SERS detection of acetamiprid

Cy3-aptamer與精胺分子作用，并吸附于銀溶膠表面產生較大的SERS信號；當溶液中存在啶蟲脒時，Cy3-aptamer先與啶蟲脒反應，再加入精胺形成SERS的“顯色”反應，探針分子Cy3-aptamer與精胺結合的分子吸附于銀溶膠表面，由于部分探針分子Cy3-aptamer與啶蟲脒結合而使得SERS信號減弱。

2.2 銀溶膠穩(wěn)定性的改善

作為SERS的基底材料銀溶膠的穩(wěn)定性至關重要，為了提高銀溶膠的長期穩(wěn)定做了一些探索和改善。Lee法制備的銀溶膠表面因為Na3C6H5O7·2H2O/檸檬酸過量，受其酸根包覆而帶負電荷?？紤]到膠體的穩(wěn)定和聚凝作用原理，在體系中加入帶負電的物質可以使膠體穩(wěn)定。經多次試驗，加入聚丙烯酸鈉作為銀溶膠的分散劑，可以有效的保持所合成的銀納米粒子均勻分散在溶液中，并保持銀溶膠的穩(wěn)定。實驗表明：制備的銀溶膠液中加入聚丙烯酸鈉濃度為0.05%時，于4 ℃棕色瓶中可以穩(wěn)定保存至少60 d。

2.3 不同聚沉劑對銀溶膠表面增強拉曼光譜的影響

測試時銀溶膠中加入電解質，可使納米溶膠表面的電荷平衡改變而發(fā)生團聚，局部表面等離子體共振發(fā)生疊加，從而形成SERS活性熱點，引起拉曼增強。不同類型的電解質，對SERS信號有不同的影響。為了考察不同聚沉劑對銀溶膠SERS的影響，以SERS信號較弱的啶蟲脒分子為探針，對其在不同聚沉劑條件下的SERS進行了測試，結果如圖2。

圖2 不同聚沉劑對SERS光譜的影響a: NaOH；b: NaCl；c：KCl；d: HCl；e: H2SO4；f: HNO3；g: H3PO4；聚沉劑濃度均為80 mmol·L-1；啶蟲脒濃度5×10-4 mol·L-1Fig.2 Effect of different aggregates on SERS spectraa: NaOH；b: NaCl；c：KCl；d: HCl；e: H2SO4；f: HNO3；g: H3PO4；the concentration of aggregates: 80 mmol·L-1；the concentration of acetamiprid：5×10-4 mol·L-1

2.4 不同聚沉劑對銀溶膠紫外-可見光譜的影響及表征

為了進一步研究聚沉劑對銀溶膠的聚沉作用和影響，考察了加入160 mmol·L-1不同的聚沉劑11 min后對銀溶膠的紫外可見吸收光譜的變化[圖3(a)]。由圖3(a)可知，銀溶膠空白溶液(本底含0.01%聚丙烯酸鈉)[圖3(a)，a]的吸收峰位置在421.10 nm，加入聚沉劑后，聚沉劑都會使銀溶膠的吸光度減小。NaCl[圖3(a),b]，HCl[圖3(a),c]和KCl[圖3(a),d]的最大吸收峰分別在420.78，420.78和417.32 nm處，產生略微藍移。而加入堿和酸均會使吸收峰產生略微紅移。NaOH[圖3(a),h]移至421.65 nm。H3PO4[圖3(a),e]，HNO3[圖3(a),f]，H2SO4[圖3(a),g]分別移至421.65，421.65和422.51 nm。說明Cl離子加入，可能與表面附著的Ag離子結合，產生氯化銀，增大了電子的躍遷能級。而H+，OH-離子作用于銀溶膠表面，由于電荷效應，使電子的躍遷能級減小。

圖3(a) 不同聚沉劑對銀溶膠紫外-可見吸收光譜的影響a: 空白；b: NaCl；c: HCl；d: KCl；e: H3PO4；f: HNO3；g: H2SO4；h: NaOH；本底為0.01%聚丙烯酸鈉Fig.3(a) UV-Vis spectra of sliver colloid affected by different aggregatesa: Blank；b: NaCl；c: HCl；d: KCl；e: H3PO4；f: HNO3；g: H2SO4；h: NaOH；blank is 0.01% sodium polyacrylate

圖3(b)為銀溶膠吸光度隨時間的變化圖，實驗表明加入NaCl[圖3(a)，b], HCl[圖3(a)，c]，KCl[圖3(a)，d]對銀溶膠的吸光度的變化值影響相對較小，而加入H3PO4[圖3(a)，e]，HNO3[圖3(a)，f]和H2SO4[圖3(a)，g]具有類似的吸光度變化，而NaOH[圖3(a),h]吸光度變化最大。結果說明，聚沉速度在一定程度上影響了SERS檢測信號，但NaOH和H3PO4，HNO3和H2SO4的吸光度變化速度相似，SERS信號差異明顯，說明表面電荷性質對SERS的增強信號起決定作用。因此，可以通過加入聚沉劑來改善銀溶膠表面的電荷狀況和提高表面增強拉曼光譜的信號，以達到高靈敏分析檢測分子的目的。

圖3(b) 不同聚沉劑加入時間對銀溶膠紫外-可見吸收光譜的影響a: NaCl；b：HCl；c：KCl；d：H3PO4；e：HNO3；f：H2SO4；g：NaOHFig.3(b) UV-Vis spectra of sliver colloid affected by the adding time of different aggregatesa: NaCl；b：HCl；c：KCl；d：H3PO4；e：HNO3；f：H2SO4；g：NaOH

2.5 Cy3-aptamer與精胺反應時間的SERS最佳條件選擇

由于Cy3-aptamer磷酸骨架上帶有較多負電荷，經試驗加入帶有正電荷的輔助“顯色劑”精胺使其產生較強的SERS信號，并考察了反應時間為5, 10, 15 min時的SERS圖(圖4)。在未加精胺的1 μmol·L-1Cy3-aptamer SERS圖4d中，可以看出Cy3指紋信息較少。推測主要是由于DNA骨架上的磷酸基團所帶的負電荷強于其堿基上所帶的正電荷，而呈現酸性，即Cy3-aptamer帶負電，而聚丙烯酸鈉分散銀溶膠體系也帶負電，以致于Cy3-aptamer不能很好的吸附到銀溶膠表面。在加入帶正電荷的精胺(圖4a,b,c)后，可以觀察到明顯的Cy3指紋信息。表明，帶正電荷的精胺分子與DNA作用后，改變了DNA骨架上的帶電狀態(tài)，使其與銀溶膠能夠產生更好的結合，同時產生SERS效應，并檢測出Cy3-aptamer的信號[14]?？疾靾D4精胺與aptamer的SERS信號與反應時間關系，反應時間對SERS影響不大，為了縮短實驗時間選擇5 min為宜。

圖4 精胺和Cy3-aptamer不同反應時間的SERS譜圖a: 5 min; b: 10 min; c: 15 min;d: 未加精胺1 μmol·L-1 Cy3-aptamer本底Fig.4 SERS spectra of different reaction time of spermine with Cy3-aptamera: 5 min; b: 10 min; c: 15 min; d: Background of 1 μmol·L-1 Cy3-aptamer without spermine

2.6 Cy3-aptamer與農藥啶蟲脒反應SERS最佳條件選擇

由于啶蟲脒與其aptamer有較強的親和作用，會與精胺在aptamer上形成競爭反應，影響“顯色劑”精胺對Cy3的“顯色效應”?？疾炝薈y3-aptamer與啶蟲脒不同反應時間(5, 10, 20, 30 min)后，進一步加入輔助“顯色劑”精胺反應5 min時Cy3在銀溶膠表面產生SERS光譜的影響(圖5)。實驗表明, 啶蟲脒與其aptamer反應20 min時Cy3的SERS信號最大，推測啶蟲脒、 Cy3-aptamer及其配合物Cy3-aptamer-啶蟲脒存在一定的平衡解離關系，且在銀溶膠表面的吸附速率不同。由于啶蟲脒的濃度過量，小分子啶蟲脒首先占據銀表面，Cy3信號較弱，隨著時間推移，帶有精胺的Cy3-aptamer逐漸靠近銀表面，使得Cy3信號增強。超過20 min 信號下降，推測主要是由于分子在銀表面的堆積，使得光散射信號傳遞受阻，因此選擇20 min為最佳反應時間。

圖5 Cy3-aptamer和啶蟲脒不同反應時間的SERS光譜圖a：5 min；b：10 min；c：20 min；d：30 minFig.5 SERS spectra of different reaction time of Cy3-aptamer with acetamiprida：5 min；b：10 min；c：20 min；d：30 min

2.7 農藥啶蟲脒與拉曼峰面積比值的關系

在所選條件下，測定了不同濃度的啶蟲脒溶液(0.25，0.1, 0.075, 0.05, 0.01 μmol·L-1)在Cy3-aptamer捕獲下的SERS圖[圖6(a)]。由圖6(a)可知隨著啶蟲脒濃度的增加，信標分子Cy3 的SERS峰強度隨之下降。為了提高測定的可靠性，選擇了本底水分子作為內標[15]組成相對強度。以1 392 cm-1處特征峰的拉曼峰面積與3 000～3 700 cm-1處水的OH伸縮振動峰的面積的比值與啶蟲脒濃度對數作關系圖[圖6(b)]。經測定，銀溶膠Cy3-aptamer方法檢測啶蟲脒的濃度線性范圍為1×10-8～2.5×10-7mol·L-1，線性回歸方程為Acy3/Awater=-0.306 5LogC-1.876，相關系數r=0.971 6。

圖6 不同濃度的啶蟲脒對SERS光譜的影響及相對強度的關系圖條件：啶蟲脒濃度 0.25, 0.1, 0.075, 0.05, 0.01 μmol·L-1Fig.6 SERS spectra of acetamiprid, 0.25, 0.1, 0.075, 0.05, 0.01 μmol·L-1, insert: linearship between logarithm of concentrations and the ratio of acetamiprid (1 392 cm-1) and water, A: area

2.8 實際樣品檢測

用采樣器采集杭州市上塘河水樣，在測試之前，樣品先用0.45 μm微濾膜過濾，以去除顆粒性懸浮物。實際水樣經本法檢測未檢出。將1.0×10-7mol·L-1的啶蟲脒標準樣品加入到水樣中，重復測量三次，相對標準偏差RSD=9.99%, 回收率為97.4%，97.5%，99.4%。

3 結 論

采用農藥啶蟲脒aptamer并標記拉曼光譜信號分子Cy3制備的Cy3-aptamer探針分子，能夠很好的與精胺作用在銀溶膠表面吸附而產生基準SERS光譜信號。啶蟲脒與Cy3-aptamer探針分子能夠形成特異性反應，減少了Cy3-aptamer與精胺的作用，而減弱了SERS的信號，從而實現了特異性分析測定農藥啶蟲脒分子的目的。利用此方法可以實現其他農藥或其他化合物的特異性分析檢測，具有一定的應用前景和研究意義。