梁任佳 李學(xué)勁 梁光纖 王華 蒙麗瓊

(中國(guó)檢驗(yàn)認(rèn)證集團(tuán)廣西有限公司，廣西 北海 536000)

0 引言

近年來(lái)，水產(chǎn)品的消費(fèi)呈逐年遞增趨勢(shì)[1]，三苯甲烷類(lèi)染料、氯霉素類(lèi)、磺胺類(lèi)、氟喹諾酮類(lèi)和四環(huán)素類(lèi)等是目前水產(chǎn)品養(yǎng)殖環(huán)節(jié)常用的病蟲(chóng)害防治藥物。按照我國(guó)相關(guān)食品安全標(biāo)準(zhǔn)，三苯甲烷類(lèi)染料、氯霉素類(lèi)由于毒性較強(qiáng)目前已經(jīng)禁止在水產(chǎn)品養(yǎng)殖等環(huán)節(jié)使用。按照《GB 31650—2019 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中獸藥最大殘留限量》，磺胺類(lèi)、氟喹諾酮類(lèi)、四環(huán)素類(lèi)為限制使用藥物[2］。本研究針對(duì)水產(chǎn)品中重點(diǎn)監(jiān)控的獸藥殘留種類(lèi)，采用液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)結(jié)合分散固相萃取方法實(shí)現(xiàn)了5 類(lèi)41 種漁用藥物殘留的同時(shí)前處理并檢測(cè)，方法簡(jiǎn)單快速，為水產(chǎn)品藥物殘留的有效監(jiān)控提供了快捷的方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與方法

1.1.1 儀器與試劑

Agilent 6470 三重串聯(lián)四極桿液相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀(帶有鞘氣裝置的電噴霧離子源)(美國(guó)Agilent 公司)；IKA-T18 型均質(zhì)器(德國(guó)IKA 公司)；BUCHI R-3 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(瑞士BUCHI公司)；MS 204S 分析天平(梅特勒－托利多儀器(上海)有限公司)；JJ1000 型常量天平(常熟雙杰電子有限公司)；TGL-16M 型高速冷凍離心機(jī)(湖南湘儀)；ELGA-Micrae+Purelab 純化水系統(tǒng)(英國(guó)ELGA 公司)。

41 種藥物的標(biāo)準(zhǔn)品及孔雀石綠苦味酸鹽-D5(MG-D5，純度98.0%)無(wú)色(隱性)孔雀石綠-D6 標(biāo)準(zhǔn)品(LMG-D6，純度96.4%)，購(gòu)自德國(guó)Dr. Ehrenstorfer 公司。

乙腈和正己烷(HPLC 級(jí)，德國(guó)Merk 公司)；甲醇(HPLC 級(jí)，西隴科學(xué)股份有限公司)；甲酸、乙酸銨(HPLC 級(jí)，美國(guó)Fluka 公司)；無(wú)水硫酸鈉(分析純，西隴科學(xué)股份有限公司)；十八烷基硅烷(C18)(上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司)；Na2EDTA·2H2O(分析純，廣東光華科技股份有限公司)；磷酸氫二鈉、一水合檸檬酸(分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；實(shí)驗(yàn)室用水為一級(jí)水(18.2 MΩ·cm)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 溶液配制

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：對(duì)于固體標(biāo)，分別稱(chēng)取相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)品10 mg (精確至0.01mg)置于10.0mL 容量瓶中，用乙腈溶解后定容至刻度，配制為濃度為1000mg/L 的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，-18℃避光保存。

標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：準(zhǔn)確吸取適量標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用乙腈逐級(jí)稀釋配制成系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

基質(zhì)空白標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：準(zhǔn)確吸取適量標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液加入6份空白樣品，同2.2.2 處理配制成系列基質(zhì)空白標(biāo)準(zhǔn)溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

Na2EDTA-Mcilvaine 緩沖溶液(0.1 mol/L):準(zhǔn)確稱(chēng)取37.2 g Na 2EDTA·2H2O、10.9g 磷酸氫二鈉和12.9g 檸檬酸于燒杯內(nèi)，加入一級(jí)水約900mL，攪拌使其溶解，使用1mol/L 的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH 至4.0，定容至1000mL 容量瓶，搖勻即可。

酸化乙腈(含1%甲酸的乙腈溶液，V/V)：準(zhǔn)確吸取1mL 甲酸于100mL 容量瓶中，用乙腈定容，混合均勻。

2.2 樣品前處理

稱(chēng)取5.0g(精確至0.1 g)樣品于50mL 具塞塑料離心管中，加 入100μL 50μg/L 內(nèi) 標(biāo) 溶 液(MG-D5 和LMG-D6)，加 入2mL Na2EDTA-Mcilvaine 緩沖溶液和10mL 酸化乙腈，渦旋1min，再加入7g 無(wú)水硫酸鈉渦旋混勻30s，超聲提取10min，4000r/min 低溫離心5min，移取上層液至另一潔凈50mL 離心管。往殘?jiān)屑尤?0mL 酸化乙腈，重復(fù)提取一次，合并兩次上層清液。向提取液中加入100mg C18 吸附劑，振搖30 s，4000r/min 低溫離心5min，上清液轉(zhuǎn)移至雞心瓶中，于40℃旋轉(zhuǎn)蒸干，用2ml 酸化乙腈-水(60+40，V/V)復(fù)溶，充分渦旋溶解管壁上的殘留物后轉(zhuǎn)入5ml 塑料離心管中，加入1mL 乙腈飽和正己烷，振搖30s，置于低溫離心機(jī)12000r/min 離心5min。取下層液過(guò)0.22μm 有機(jī)濾膜后上機(jī)。

液相色譜-質(zhì)譜條件

(1)正離子模式

色譜柱：Zorbax eclipse Plus C18 色譜柱(2.1×100mm，1.8μm)；進(jìn)樣量：10μL；柱溫：35℃；流動(dòng)相：A 相為0.1%甲酸+10mmol/L 乙酸銨水溶液，B 相為乙腈；流速：0.4ml/min。

電離方式：電噴霧正離子源(ESI+)；檢測(cè)模式：MRM；毛細(xì)管電壓：4.0kV；干燥氣溫度：350℃；干燥氣流量：11.0L/min；鞘氣(N2)流量：11ml/min，鞘氣(N2)溫度：350℃。

(2)負(fù)離子模式

色譜柱：Zorbax eclipse Plus C18 色譜柱(2.1×100mm，1.8μm)；進(jìn)樣量：10μL；柱溫：35℃；流動(dòng)相：A 相為水，B 相為甲醇；流速： 0.4ml/min。

電離方式：電噴霧正離子源(ESI-)；檢測(cè)模式：MRM；毛細(xì)管電壓：3.5kV；干燥氣溫度：350℃；干燥氣流量：11.0L/min；鞘氣(N2)流量：11ml/min，鞘氣(N2)溫度：350℃。

3 結(jié)果與討論

3.1 樣品前處理的優(yōu)化

3.1.1 提取溶劑的優(yōu)化

本研究中對(duì)象為磺胺類(lèi)、氟喹諾酮類(lèi)、氯霉素類(lèi) 、三苯甲烷類(lèi)染料和四環(huán)素類(lèi)，根據(jù)目前分別已有國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)和相關(guān)文獻(xiàn)可知，磺胺類(lèi)用乙腈水溶液提取，氟喹諾酮類(lèi)用甲酸乙腈提取，氯霉素類(lèi)用乙酸乙酯提取，三苯甲烷類(lèi)染料用乙腈提取，四環(huán)素類(lèi)用Na2EDTA-Mcllvaine 緩沖溶液提取均有良好的效果。乙腈的提取效果優(yōu)于甲醇、乙酸乙酯，且乙腈不會(huì)提取出較多的基質(zhì)雜質(zhì)，同時(shí)乙腈有沉降蛋白的作用，故設(shè)定乙腈、1%甲酸乙腈和1%甲酸乙腈+0.1 mol/L Na2EDTA-Mcllvaine (3+7，V/V)緩沖溶液組合等3 種提取液進(jìn)行初篩提取效果的比較，結(jié)果表明：采用純乙腈提取，對(duì)于磺胺類(lèi)、三苯甲烷類(lèi)染料和氯霉素類(lèi)效果良好，加標(biāo)回收率在60%～130%之間，對(duì)氟喹諾酮類(lèi)一般，只有50%～70%之間，對(duì)于四環(huán)素類(lèi)沒(méi)有回收；采用1%甲酸乙腈，對(duì)于磺胺類(lèi)、三苯甲烷類(lèi)染料、氯霉素和氟喹諾酮類(lèi)均良好，回收率均在70%～130%之間，對(duì)于四環(huán)類(lèi)回收率不到20%；而采用1%酸化乙腈和0.1mol/L Na2EDTA-Mcllvaine 緩沖溶液混合提取對(duì)于四環(huán)素的提取起到了明顯的作用，回收率一般達(dá)到了50%以上，其他類(lèi)的回收率均能達(dá)到70%以上；因此選定酸化乙腈+Na2EDTA-Mcllvaine 緩沖溶液組合進(jìn)行比例的研究，設(shè)定了緩沖溶液與酸化乙腈體積比分別為0.5:10、1:10、2:10、3:10、4:10、5:10 六組不同比例提取劑。發(fā)現(xiàn)體積比為 2:10 時(shí)，四環(huán)素類(lèi)化合物的回收率能達(dá)到80%以上；其余不同體積比的回收率提升和提取效率無(wú)顯著差異。

3.1.2 除水劑和凈化劑的選擇

無(wú)水硫酸鎂除水劑中的鎂離子易與四環(huán)素類(lèi)形成絡(luò)合物從而影響四環(huán)素類(lèi)的回收率，因此本方法采用無(wú)水硫酸鈉除水，通過(guò)實(shí)際測(cè)定發(fā)現(xiàn)，在本試驗(yàn)條件下加入量為7g 時(shí)能充分除去樣品中水分。分散固相萃取是將吸附劑直接加入提取液中振搖凈化，目前此技術(shù)已較多應(yīng)用于農(nóng)藥殘留分析［3-4］，C18 能夠吸附脂肪等強(qiáng)疏水性干擾物，但是凈化往往是個(gè)雙面的，一方面在凈化的同時(shí)可能會(huì)吸附掉目標(biāo)化合物，因此需進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，配制5ml 10μg/L 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別加入50mg、100mg、200mg、300mg、400mg 吸附劑，測(cè)定各目標(biāo)物的加標(biāo)回收率，通過(guò)實(shí)際測(cè)定發(fā)現(xiàn)，當(dāng)C18 加入量超過(guò)200mg 時(shí)，對(duì)三苯甲烷類(lèi)染料有嚴(yán)重的吸附，對(duì)其他類(lèi)沒(méi)有多大影響。

3.1.3 定容液的選擇

本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)定容復(fù)溶液對(duì)目標(biāo)化合物的峰形有較大影響，當(dāng)定容復(fù)溶液為純乙腈時(shí)雖充分保證能完全溶解殘留在雞心瓶壁上的目標(biāo)物，但是由于跟測(cè)定時(shí)的初始流動(dòng)相比例性質(zhì)相差太大，存在明顯的類(lèi)似液相色譜分析中產(chǎn)生的溶劑效應(yīng)，對(duì)所有氟喹諾酮類(lèi)峰形有影響，出峰有開(kāi)叉現(xiàn)象，對(duì)磺胺類(lèi)3 種物質(zhì)也有同樣的現(xiàn)象，為了改善峰形。經(jīng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)乙腈-水(6:4)為定容溶液時(shí)，各目標(biāo)物峰形良好。

3.2 儀器條件優(yōu)化

3.2.1 色譜柱的選擇

選取Zorbax 品牌的poroshell 120 SB-C18、Eclipse Plus C18和SB-C18(均為100mm×2.1mm，1.8μm)三種色譜柱進(jìn)樣，綜合考慮分離度，出峰時(shí)間和峰型的對(duì)稱(chēng)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn) Eclipse Plus C18 色譜柱分離度最好，且所出目標(biāo)物峰最對(duì)稱(chēng)、靈敏度最高，因此本實(shí)驗(yàn)選擇Zorbax Eclipse Plus C18 色譜柱進(jìn)行實(shí)際測(cè)定，ESI+、ESI-模式下分析目標(biāo)物的總離子流圖見(jiàn)圖1，圖2。

3.2.2 流動(dòng)相的選擇

圖1 ESI+模式基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液(濃度均為10.0μg/L)的總離子流圖

圖2 ESI-模式基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液(濃度均為10.0μg/L)的總離子流圖

ESI+模式電離條件下，流動(dòng)相水相中加入0.1%甲酸和乙酸銨，可顯著改善和增強(qiáng)酸堿化合物的峰形及保留性，因此正離子模式下本實(shí)驗(yàn)有機(jī)相設(shè)定為乙腈，水相為0.1 甲酸+乙酸銨體系，設(shè)定了0.1%甲酸+2mmol 乙酸銨，0.1%甲酸+5mmol乙酸銨，0.1%甲酸+10mmol 乙酸銨三組水相體系進(jìn)行實(shí)際實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)當(dāng)隨著乙酸銨濃度的增加，對(duì)于磺胺類(lèi)、氟喹諾酮類(lèi)和四環(huán)素類(lèi)影響不大，但對(duì)于三苯甲烷類(lèi)有著明顯影響，乙酸銨濃度增加，三苯甲烷類(lèi)出峰時(shí)間相對(duì)延后，同時(shí)相互之間的分離度變好，0.1%甲酸+2mmol 乙酸銨，0.1%甲酸+5mmol 乙酸銨條件下，盡管不斷調(diào)整優(yōu)化水相和有機(jī)相的梯度沖洗程序，但三苯甲烷類(lèi)中的隱色孔雀石綠和隱色結(jié)晶紫出峰時(shí)間基本重疊，當(dāng)水相體系為0.1%甲酸+10mmol 乙酸銨時(shí)，隱色孔雀石綠和隱色結(jié)晶紫出峰時(shí)間分離時(shí)間相差在0.3min 以上。

3.3 方法學(xué)驗(yàn)證

線性范圍、檢出限和定量限

取已測(cè)定為陰性的對(duì)蝦樣品，加入適量的獸藥標(biāo)準(zhǔn)液，進(jìn)行線性回歸、檢出限和定量限測(cè)試，以信噪比(S/N)≥3、(S/N)≥10確定各組分的檢出限和定量限。通過(guò)實(shí)際測(cè)定，在本方法的試驗(yàn)條件下，其靈敏度滿(mǎn)足我國(guó)水產(chǎn)品藥物殘留監(jiān)控的限量要求。

4 結(jié)語(yǔ)

本研究利用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜，建立了同時(shí)提取水產(chǎn)品中磺胺類(lèi)、氟喹諾酮類(lèi)、四環(huán)素類(lèi)、氯霉素類(lèi)和三苯甲烷類(lèi)共41種常見(jiàn)漁用獸藥，正、負(fù)離子模式下分別檢測(cè)的分析方法。該方法檢測(cè)成本低、周期短、穩(wěn)定性好、準(zhǔn)確度高。