陽彥 劉艷秋 羅海艷 鄒歡歡 馬鵬鵬

江西省婦幼保健院產前診斷中心（南昌330006）

先天性耳聾是人類最常見的出生缺陷之一，是全球重大公共衛(wèi)生問題，2014年WHO 估計，全球因聾致殘人數(shù)高達3.6 億，約占世界總人口5.14%［1］。新生兒聽力篩查為全國新生兒重點篩查三大疾病篩查之一，2010年衛(wèi)生部頒布了《新生兒聽力篩查技術規(guī)范》，旨在盡早發(fā)現(xiàn)有聽力障礙的個體，并及時給予適當干預，避免由聾致啞。隨著新生兒聽力篩查工作的深入進行，國內外研究均報道單純聽力篩查可能會漏診遲發(fā)性耳聾患兒及藥物性耳聾基因攜帶者。2007年，新生兒聽力聯(lián)合基因篩查的理念被首次提出［4］。近年來，新生兒聽力與基因聯(lián)合篩查越來越被醫(yī)學界所關注，為耳聾三級預防的有效手段。

本研究聯(lián)合新生兒聽力篩查與耳聾基因芯片技術對6 957 例新生兒進行常見耳聾基因的檢測，在前人研究［5-7］基礎上，增加了對雜合攜帶者進行相應基因Sanger 測序，避免漏診非熱點突變的耳聾患兒，以達到降低耳聾發(fā)生率，同時初步明確江西地區(qū)非綜合征型耳聾基因突變熱點與突變譜，達到完善我國非綜合征型耳聾分子流行病學數(shù)據(jù)的目的。

1 對象與方法

1.1 研究對象2011年11月至2019年6月江西省婦幼保健院產科出生的6 957 例正?；町a新生兒，出生時Apgar 評分均為10 分，所有新生兒均為母嬰同室，均無產科并發(fā)癥，不包括伴聽力損失高危因素的新生兒。父母均為江西籍貫。聯(lián)合篩查前均進行充分知情告知并簽署知情同意書。該研究符合2013 修訂的《赫爾辛基宣言》（www.wma.net/en/30publications/10policies/b3/index.html）的要求，本研究通過江西省婦幼保健院倫理委員會的審批。

1.2 方法

1.2.1 聽力篩查方法新生兒于出生3 d 后采用耳聲發(fā)射法（otoacousticemission，OAE）進行初次聽力篩查，初篩不通過者在出生后29～42 d 進行復篩，復篩采用OAE 與自動判別聽性腦干誘發(fā)電位法（auto auditorybrainstemresponse，AABR）結合檢測。復篩未通過者，于3 個月齡進行聽性腦干反應（auditory brainstem response，ABR）進行診斷。

1.2.2 耳聾基因檢測方法采取新生兒EDTA抗凝血1 mL，采用天隆NP968DNA 自動提取系統(tǒng)標準操作規(guī)程提取基因組DNA，采用NanoDrop2000 測定DNA 濃度與純度，應用晶芯?9 項遺傳性耳聾基因檢測試劑盒（微陣列芯片法）對4 個耳聾基因的9 個位點進行檢測，包括GJB2（c.235delC，c.299_300delAT，c.176_191del16 ，c.35delG）、SLC26A4（IVS7-2A＞G，c.2168A＞G）、線粒體12SrRNA（m.1555A＞G，m.1494C＞T）和GJB3（c.538C＞T）。具體實驗操作參見試劑盒說明書。

1.2.3 雜合突變攜帶者基因測序對耳聾基因芯片檢測結果為雜合突變攜帶者進一步行相應基因測序，按相應擴增條件完成PCR 測序后送上海生工測序，部分引物序列見表1，序列分析軟件為FinCH TV。

1.3 統(tǒng)計學方法建立EXCEL 數(shù)據(jù)庫，采用SPSS 19.0進行χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 新生兒耳聾基因芯片檢測結果共完成6 957例新生兒耳聾基因檢測，檢出耳聾基因突變新生兒282 例，其中GJB2 基因雜合突變142 例，GJB2 c.235delC 純合突變1 例，雙雜合突變3 例，分別為c.235delC/c.299_300 del AT雙雜合、GJB2 c.235delC/c.109 A＞G 雙雜合、GJB2 c.235delC/m.1555A＞G 均質突變以及1 例3 個突變的復合雜合突變GJB2c.235delC/SLC26A4IVS7-2A＞G/SLC26A4 c.109G＞T 。GJB2 c.35delG 雜合突變1 例（0.01%），GJB2 c.176_191del16 雜合突變7 例（0.1%），GJB2 c.299_300delAT 雜合突變28 例（0.4%）。發(fā)現(xiàn)GJB3 c.538C＞T雜合突變7 例（0.1%），SLC26A4 雜合突變68 例，其中SLC26A4IVS7-2A＞G 雜合突變52 例（0.74%），c.2168A＞G雜合突變16例（0.22%），SLC26A4 IVS7-2A＞G 復合c.1173C＞A 1例（0.01%）。另發(fā)現(xiàn)線粒體基因突變26 例（0.37%），包括線粒體12SrRNA m.1555A＞G 均質突變20 例（0.28%），1 例為GJB2 c.235delC/m.1555A＞G 均質突變雙雜合突變。m.1555A＞G 異質突變3 例（0.04%），線粒體12S rRNA1494 C＞T 均質突變1 例（0.01%），異質突變1 例（0.01%）。基因芯片檢測原始數(shù)據(jù)見圖1，基因突變類型及等位基因攜帶頻率見表2，所有突變攜帶者均進行相應基因測序。

2.2 新生兒耳聾基因芯片檢測雜合攜帶者測序結果282 例攜帶者中，除25 例單純?yōu)榫€粒體突變攜帶者外，257 例進行了相應基因測序，基因芯片檢測結果經測序復核為一致，在基因芯片檢測結果的基礎上，測出GJB2 c.235delC/c.109A＞G 1例，SLC26A4 IVS7-2A＞G/c.1173C＞A 1例，GJB2c.235delC/SLC26A4IVS7-2A＞G/SLC26A4 c.109G＞T 1 例，其中GJB2 c.109A＞G、SLC26A4c.1173C＞A、SLC26A4 c.109G＞T為芯片無法檢測位點，經OMIM、HGMD 數(shù)據(jù)庫查詢均為已知致病突變。見圖2。

2.3 新生兒聽力篩查聯(lián)合耳聾基因檢測結果分析在進行了耳聾基因與聽力篩查聯(lián)合分析的6 957 例新生兒中，初篩未通過504 例，初篩陽性率7.24%。初篩未通過者在29～42 d 時接受復篩，復篩未通過88 例，復篩陽性率1.26%。聽力篩查未通過者中88 例均在3 個月齡進行了聽力學診斷，最終確診5 例耳聾患者，分別為雙耳極重度感音神經性耳聾2 例，左耳極重度感音神經性耳聾/右耳中重度感音神經性耳聾1 例、雙耳中重度感音神經性耳聾1 例，2 例雙耳極重度感應神經性耳聾患兒分別為GJB2 c.235delC 純合突變，GJB2c.235delC/c.299_300delAT，左耳極重度感音神經性耳聾/右耳中重度感音神經性耳聾基因型為SLC26A4IVS7-2A＞G/c.1173C＞A，雙耳中至重度感音神經性耳聾基因型為GJB2c.235delC/SLC26A4IVS7-2A＞G/SLC26A4c.109G＞T，雙耳輕中度感音神經性耳聾1 例，基因型為GJB2 c.235delC/c.109 A＞G。

3 討論

自1988年第一個耳聾基因被定位，1995年發(fā)現(xiàn)第1 個NSHL 基因POU3F4 并被成功克?。?］，1997年發(fā)現(xiàn)最常見的NSHL致聾基因GJB2以來［9］，20年來遺傳性耳聾的研究取得了飛速發(fā)展。目前大量研究［10-15］證明，GJB2、SLC26A4、mtDNA12SrRNA是導致大部分NSHL 的主要致病基因。新生兒聽力篩查聯(lián)合基因檢測在耳聾出生缺陷防控中具有重要意義。Joint Committee on Infant Hearing［3］、王秋菊等［6］分別在2006年、2007年提出了新生兒聽力與基因聯(lián)合篩查的理念，至今，聯(lián)合篩查已在國內外廣泛展開。

表1 部分測序引物序列Tab.1 Primer sequences of Sanger sequencing method

表2 6 957 例新生兒耳聾基因芯片結合基因測序檢測結果突變類型及等位基因頻率分布Tab.2 Mutation type and allele frequency of 6 957 cases of newborns detected by neonatal deafness gene chip combined with gene sequencing

6 957 例新生兒中，初篩未通過504 例，初篩陽性率7.24%。為了排除羊水或胎脂堵塞耳道、鼓室內有羊水、耵聹堵塞、外耳道狹窄、新生兒候鳴聲干擾、機器校準有異常等因素對聽力篩查的影響，初篩未通過者在29～42 d 時接受復篩，復篩未通過88 例，復篩陽性率1.26%，與國內多項研究［16-23］中新生兒聽力篩查結果數(shù)據(jù)接近。

圖1 基因芯片檢測常見耳聾基因9 個突變位點原始數(shù)據(jù)圖Fig.1 Original graph of 9 mutation sites of common deafness genes detected by gene chip

耳聾基因突變存在地域和種族差異，因此，明確當?shù)囟@基因突變譜對耳聾出生缺陷防控具有重要意義。江西地區(qū)人口流動率較低，本研究納入的新生兒父母均為江西籍貫，本研究數(shù)據(jù)能反映本地區(qū)耳聾基因突變熱點。在6 957 例新生兒中，檢出攜帶者282 例，約占總數(shù)的4.05%，該數(shù)據(jù)接近于文獻報道的4.17%～5.15%［16-23］，共檢出GJB2基因突變183 例，突變攜帶率為2.6%，其中GJB2 c.235delC 雜合突變攜帶142 例，GJB2 c.235delC 純合突變1 例，GJB2c.235delC/c.299_300delAT 雙雜合1 例、GJB2 c.235delC/c.109 A＞G 雙雜合1 例、GJB2c.235delC/m.1555A＞G 均質突變1 例、GJB2 c.235delC/SLC26A4 IVS7-2A＞G/SLC26A4 c.109G＞T雜合突變1例、c.35delG雜合突變1例、GJB2c.176_191del16 雜合突變7 例、GJB2c.299_300 del AT 雜合突變28 例，GJB2 c.235delC 位點突變共147 例，突變攜帶率為2.1%，高于文獻報道的1.651%～1.975%［16-23］，GJB2 基因為本地區(qū)最常見的耳聾基因，其突變熱點為GJB2 c.235delC，與上述文獻結論一致。

圖2 部分突變位點測序峰圖Fig.2 Original graph of sequencing of some mutation sites

在6 957 例新生兒中，共檢出SLC26A4 突變70例，其中IVS7-2A＞G雜合突變52例，復合雜合突變2 例，分別為SLC26A4 IVS7-2A＞G 與c.1173C＞A 復合雜合突變、GJB2 c.235delC/SLC26A4 IVS7-2A＞G/SLC26A4 c.109G＞T雜合突變1例，SLC26A4基因突變攜帶率為1.006%，SLC26A4IVS7-2A＞G突變攜帶率為0.77%，SLC26A4c.2168 A＞G 雜合突變16 例，突變攜帶率為0.22%，與上述幾個大樣本研究數(shù)據(jù)接近。SLC26A4 為本地區(qū)第2 大耳聾易感基因，其突變熱點為SLC26A4 IVS7-2A＞G。

本研究共檢測出GJB3 c.538C＞T雜合突變7例，突變攜帶率為0.1%，低于文獻［16-23］報道的0.324%～0.369%。檢出線粒體突變共27 例，突變攜帶率為0.38%，均高于上述研究中的0.224%～0.345%，說明江西地區(qū)線粒體突變攜帶率較高，聽力篩查聯(lián)合耳聾易感基因檢測極大的降低了本地區(qū)藥物性耳聾發(fā)生率，具有重大意義。

對比以往研究，本研究特色在于對基因芯片檢出耳聾基因攜帶者進行了相應基因測序，從而檢出3 例復合雜合突變攜帶者，分別為GJB2 c.235delC/109 A＞G

復合雜合突變，GJB2c.235delC/SLC26A4 IVS7-2A＞G/SLC26A4 c.109G＞T復合雜合突變，SLC26A4 IVS7-2A/c.1173C＞A 復合雜合突變，此3 例均未通過兩次聽力篩查，并通過聽性腦干反應確診為先天性感音神經性耳聾，其中GJB2 c.235delC/109A＞G突變?yōu)檩p至中度耳聾，其余2 例均為重度感音神經性耳聾。

本次檢測中測出的GJB2 c.109 A＞G 的致病性尚存在一定爭議，RYDZANICZ 等［24］研究表明其與輕至中度耳聾有關。

但越來越多的研究表明，GJB2 c.109 A＞G 可能為良性多態(tài)。因此GJB2 c.235delC/109A＞G 突變?yōu)檩p至中度耳聾此例患者需進一步采用耳聾panel 或家系全外顯子組測序技術對耳聾病因進行鑒定，筆者將持續(xù)隨訪并建議進一步檢查，觀測其聽力損失狀態(tài)。新生兒聽力篩查聯(lián)合耳聾基因檢測對本地區(qū)耳聾三級防控具有重要意義，有利于發(fā)現(xiàn)遲發(fā)型耳聾、避免藥物性耳聾，以及指導耳聾基因攜帶家系再生育，具有重大意義。