鐘圣鵬 殷俊 傅文凡 江澤勇 戴璐 鄧博云 趙健

廣州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院肺腫瘤外科（廣州510095）

叉頭盒（forkhead-box，F(xiàn)OX）轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因家族是一個(gè)進(jìn)化保守的轉(zhuǎn)錄因子家族，F(xiàn)OX 家族蛋白參與細(xì)胞生長、分化、胚胎發(fā)生和衰老等多種生物學(xué)過程，是調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄和DNA 修復(fù)的DNA 結(jié)合蛋白［1-2］。FOX 基因家族不僅在胚胎發(fā)育過程中起核心作用，而且在成人體中也起核心作用，研究表明，F(xiàn)OX 家族基因的失調(diào)和（或）突變往往會誘發(fā)人類的遺傳疾病，導(dǎo)致癌癥或衰老［3-5］。

叉頭盒轉(zhuǎn)錄基因F1（forkhead box-F1，F(xiàn)OXF1）是FOX 轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因家族重要的一員，位于人類染色體16q24.1，F(xiàn)OXF1 與多種器官特別是肺的發(fā)生發(fā)育及功能的維持密切相關(guān)［6-9］。胚胎時(shí)期，F(xiàn)OXF1 轉(zhuǎn)錄因子就是正常肺形態(tài)發(fā)生不可缺少的因素，F(xiàn)OXF1 可以維持肺內(nèi)皮細(xì)胞的屏障功能，防止肺損傷后出現(xiàn)水腫，對于正常肺內(nèi)穩(wěn)態(tài)和損傷后的肺修復(fù)來說FOXF1 是必需的［10-12］。研究表明FOXF1 基因與多種癌癥的發(fā)生發(fā)展有著密切的聯(lián)系［6，13-15］，GIALMANIDIS 等［14］發(fā)現(xiàn)在Hedgehog 陽性非小細(xì)胞肺癌中FOXF1的大量表達(dá)，但對于FOXF1在非小細(xì)胞肺癌中發(fā)揮的具體作用及其機(jī)制尚未有研究報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過調(diào)控FOXF1 基因的表達(dá)，研究其對非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化、遷移和侵襲的影響和作用機(jī)制，以探究FOXF1 是否可作為一個(gè)潛在的腫瘤治療的新靶標(biāo)或轉(zhuǎn)移標(biāo)志物。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及主要試劑人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株P(guān)C9 由廣州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所提供并保存；shRNA 慢病毒及陰性對照病毒由GeneCopoeia 公司設(shè)計(jì)合成；RPMI-1640 培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶購自GIBCO 公司；CCK-8 細(xì)胞增殖試劑盒及實(shí)時(shí)熒光定量qRT-PCR 檢測試劑盒購自上海翊圣生物科技有限公司；Tranwell 小室購自美國Corning 公司；FOXF1 抗體購自Abcam 公司，β-Catenin、N-cadherin、Vimentin、Snail、E-cadherin、ZO-1抗體購自Cell Signaling Technology（CST）公司，GAPDH 抗體購自Affiniti 公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)將PC9 細(xì)胞在含10%胎牛血清的RPIM-1640 完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)于37 ℃、5%CO2飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，2 d 換液1 次，待細(xì)胞融和度達(dá)80%～90%，用0.25% Trypsin-EDTA溶液消化傳代，取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定株的構(gòu)建根據(jù)FOXF1 基因序列，由GeneCopoeia 公司設(shè)計(jì)合成特異序列的shRNA 慢病毒（命名為shFOXF1），同時(shí)合成陰性對照shRNA（命名為shControl）。取對數(shù)生長期PC9 細(xì)胞，將細(xì)胞隨機(jī)分為shRNA 敲低組和陰性對照組，按照shRNA 慢病毒操作說明進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染成功后傳代培養(yǎng)，嘌呤霉素藥物篩選，構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量Real-time RT-PCR收集對數(shù)生長期shRNA 敲低組和陰性對照組細(xì)胞，使用TRIzol 試劑盒提取細(xì)胞總RNA，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，以GAPDH 為參照，采用2-△△Ct法計(jì)算FOXF1 mRNA 的相對表達(dá)量。GAPDH 引物序列：Forward：5′-GACTCATGACCACAGTCCATGC-3′，Reverse：5′-AGAGGCAGGGATGATGTTCTG-3′。兩對FOXF1 基因PCR 引物序列：Forward 1：5′-TCCCTGGAGCAGCCGTAT-3′，Reverse 1：5′-GCGACTGCGAGTGATACCG-3′；Forward 2：5′-CACTCCCTGGAGCAGCCGTATC-3′，Reverse 2：5′-AAGGCTTGATGTCTTGGTAGGTGA-3′。

1.2.4 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖采用CCK-8 法，取對數(shù)生長期細(xì)胞，配置2.0×104/mL 細(xì)胞懸液，接種于96 孔板，每孔加入100 μL 細(xì)胞懸液，實(shí)驗(yàn)設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，常規(guī)培養(yǎng)。貼壁后分別培養(yǎng)0、24、48、72、96、120 h，加10%CCK-8 溶液孵育1 h，吸出孔內(nèi)液體，加入另一空白96 孔板中上機(jī)檢測，震蕩混勻10 s，酶標(biāo)儀于450 nm 波長處讀取OD值，以測量時(shí)間點(diǎn)為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)繪制生長曲線。

1.2.5 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖取對數(shù)生長期的各組細(xì)胞，分別用0.25%Trypsin-EDTA 溶液消化并吹打成單個(gè)細(xì)胞，使用含10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基，將細(xì)胞懸液作梯度倍數(shù)稀釋，每組細(xì)胞分別以每皿1 000、500 個(gè)細(xì)胞的密度分別接種于6 孔板中，置于37 ℃、5%CO2飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10～14 d，當(dāng)培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見的克隆時(shí)，終止培養(yǎng)。用PBS 浸洗，加4%多聚甲醛固定細(xì)胞，結(jié)晶紫染液染色后，將6 孔板倒置并疊加一張帶網(wǎng)格的透明膠片，用肉眼直接計(jì)數(shù)克隆數(shù)。

1.2.6 Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移準(zhǔn)備Corning Transwell 遷移小室及24 孔板，用無血清RPMI-1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105/mL，取200 μL 加入上室，將500 μL含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基加入下室，培養(yǎng)箱培養(yǎng)36 h后取出小室，PBS洗滌3遍，4%多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色，PBS洗滌3遍，棉簽輕柔擦去上室面細(xì)胞，將小室置于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞數(shù)量。

1.2.7 Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲準(zhǔn)備Corning Transwell 侵襲小室及24 孔板，水化基底膜，向每個(gè)小室上室中加入50 μL無血清培養(yǎng)基，置于37 ℃培養(yǎng)箱30 min后，吸走培養(yǎng)基；使用無血清RPMI-1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105/mL，取200 μL 加入上室，將500 μL 含20%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基加入下室，培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h 后取出小室，后續(xù)同1.2.6 操作步驟。

1.2.8 Western Blot 法檢測細(xì)胞FOXF1 蛋白的表達(dá)收集對數(shù)生長期的細(xì)胞，加入適量RIPA 裂解液和蛋白酶抑制劑PMSF，冰浴裂解細(xì)胞30 min，4 ℃12 000g離心15 min，吸取上清液，BCA 試劑盒定量蛋白濃度，100 ℃煮沸10 min 后進(jìn)行SDSPAGE 電泳。將蛋白半干電轉(zhuǎn)于PDVF 膜上，5%脫脂牛奶封閉1 h 后，加入FOXF1（1∶5 000）、GAPDH（1∶4 000）、β-Catenin（1∶2 000）、N-cadherin（1∶2 000）、Vimentin（1∶2 000）、Snail（1∶2 000）、Slug（1∶2 000）、E-cadherin（1∶2 000）、ZO-1（1∶2 000）抗體4 ℃平衡搖床輕搖孵育過夜。TBST 洗去一抗，加入IgG-HRP 標(biāo)記二抗（1∶5 000），室溫孵育1～2 h：TBST 洗膜3次，化學(xué)發(fā)光法顯影，以GAPDH作為內(nèi)參。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，GraphPad Prism 7.0 版軟件處理數(shù)據(jù)分析作圖，數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，實(shí)驗(yàn)組間比較采用兩樣本均數(shù)t檢驗(yàn)，多組之間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 shRNA-FOXF1 對PC9 細(xì)胞的沉默效果在PC9細(xì)胞中轉(zhuǎn)染shRNA-FOXF1慢病毒后，其FOXF1基因表達(dá)水平下調(diào)。Real-time PCR 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的FOXF1 mRNA 表達(dá)水平明顯下調(diào)（P＜0.01，圖1）。Western Blot 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染shRNA 慢病毒后細(xì)胞FOXF1 蛋白的表達(dá)量明顯減少（P＜0.05，圖2）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示轉(zhuǎn)染成功，有效的干預(yù)FOXF1 的表達(dá)。

圖1 Real-time RT-PCR 檢測PC9 細(xì)胞系中FOXF1 mRNA水平Fig.1 FOXF1 mRNA levels were determined by real-time PCR in PC9 cell lines

2.2 FOXF1 沉默對細(xì)胞增殖的影響CCK8 增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3示，以450 nm 波長的OD值表示細(xì)胞增殖水平，在0、24、48、72、96、120 h 等時(shí)間段比較實(shí)驗(yàn)組與對照組的OD值。結(jié)果與對照組相比，轉(zhuǎn)染shRNA 抑制FOXF1 表達(dá)后，PC9 細(xì)胞的增殖能力顯著降低，在72～120 h 細(xì)胞增殖能力下降變得明顯，實(shí)驗(yàn)組與對照組的OD值變化趨勢有顯著差異（P＜0.01）。平板克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4示，同樣表明抑制FOXF1 表達(dá)后，PC9 細(xì)胞克隆形成能力顯著下降（P＜0.01）。

圖2 Western Blot 實(shí)驗(yàn)檢測FOXF1 蛋白水平的變化Fig.2 Experssion of FOXF1 protein were measured by Western Blot

圖3 CCK-8 法檢測FOXF1 沉默對PC9 細(xì)胞增殖的影響Fig.3 The cell counting kit-8 assay was conducted to determine the effect of down-regulation of FOXF1 expression on proliferation of PC9 cells

2.3 FOXF1 沉默對PC9 細(xì)胞遷移、侵襲能力的影響Transwell 遷移實(shí)驗(yàn)表明，shRNA-FOXF1 干擾后，PC9 細(xì)胞遷移能力相對于對照組細(xì)胞明顯降低（圖5A、C），shRNA-FOXF1 組中PC9 細(xì)胞的遷移率為（25.30±7.42）%，與對照組（100±13.00）%相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），表明沉默F(xiàn)OXF1可抑制癌細(xì)胞的體外遷移能力。Transwell 侵襲實(shí)驗(yàn)表明，shRNA-FOXF1 干擾后，PC9 細(xì)胞侵襲能力相對于對照組細(xì)胞明顯降低（圖5B、D），shRNAFOXF1 組中PC9 細(xì)胞的侵襲率為（12.80±2.78）%，與對照組（100±14.51）%相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），表明沉默F(xiàn)OXF1 可抑制癌細(xì)胞的體外侵襲能力。

圖4 平板細(xì)胞克隆形成試驗(yàn)檢測細(xì)胞集落/克隆能力Fig.4 The plate colony were conducted to test for tumorigenicity of PC-9 cells

圖5 FOXF1 沉默對PC9 細(xì)胞遷移與侵襲能力的影響（×10）Fig.5 The effect of shRNA-FOXF1 on migration and invasion in PC9 cells（×10）

2.4 FOXF1 沉默處理對細(xì)胞EMT 相關(guān)基因表達(dá)的影響Western Blot 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對照組細(xì)胞相比，shRNA-FOXF1 轉(zhuǎn)染PC9 細(xì)胞后，EMT 相關(guān)基因β-Catenin 、N-cadherin、Vimentin、Snail 表達(dá)下調(diào)，E-cadherin、ZO-1 表達(dá)上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖6）。

3 討論

圖6 FOXF1 沉默對細(xì)胞EMT 相關(guān)基因表達(dá)的影響Fig.6 Down-regulation of FOXF1 expression affects cell EMT-related gene expression

腫瘤進(jìn)展、轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致肺癌患者死亡的根本原因［16-17］，若在腫瘤轉(zhuǎn)移初始就提早發(fā)現(xiàn)改變治療方案或針對腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)制進(jìn)行針對治療，對于延長中晚期肺癌患者的生存期具有十分重要的臨床意義。FOX 轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因家族許多成員已被研究證實(shí)是調(diào)控腫瘤發(fā)生發(fā)展的抑癌/癌基因，F(xiàn)OXF1基因是作為FOX基因家族中重要的一員，很多研究者對其進(jìn)行了研究。部分研究者發(fā)現(xiàn)FOXF1的表達(dá)降低了腫瘤細(xì)胞的生長和入侵的潛力，認(rèn)為FOXF1 基因是抑癌基因［18］；而更多研究結(jié)果認(rèn)為FOXF1 是一類癌基因，證實(shí)FOXF1 能通過激活Hedgehog、MAPK、ERK5 等通路來促進(jìn)上皮-間皮細(xì)胞轉(zhuǎn)變表型和增強(qiáng)侵襲性潛能［13，19］。不同甚至相同癌癥類型中的這些相互矛盾的發(fā)現(xiàn)表明FOXF1在癌發(fā)生中的作用是復(fù)雜的，可能取決于腫瘤類型或組織特異性。研究［14］發(fā)現(xiàn)在Hedgehog（HH）陽性非小細(xì)胞肺癌中FOXF1 大量表達(dá)，這種高豐度與轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，本課題組前期工作中通過基因芯片測序技術(shù)及RT-qPCR 實(shí)驗(yàn)檢測非小細(xì)胞肺癌組織中FOXF1 表達(dá)水平同樣驗(yàn)證了這一結(jié)論。為進(jìn)一步探討和研究FOXF1 與非小細(xì)胞肺癌發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系，加深對FOXF1 基因特性的認(rèn)識，本實(shí)驗(yàn)采用shRNA干擾技術(shù)沉默F(xiàn)OXF1的表達(dá)，首次在體外研究FOXF1 對肺腺癌細(xì)胞PC9 的增殖、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和遷移和侵襲能力的直接影響，為判斷FOXF1 能否作為非小細(xì)胞肺癌基因治療的新靶點(diǎn)或腫瘤轉(zhuǎn)移標(biāo)志物提供一定的依據(jù)。

本研究設(shè)計(jì)合成針對FOXF1 的特異性shRNA慢病毒，對非小細(xì)胞肺癌PC9 細(xì)胞株進(jìn)行轉(zhuǎn)染，RT-PCR 實(shí)驗(yàn)和Western Blot 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染后PC9細(xì)胞中FOXF1基因表達(dá)顯著降低，表明FOXF1基因表達(dá)被抑制。CCK-8 實(shí)驗(yàn)和平板克隆實(shí)驗(yàn)表明FOXF1 沉默后PC9 細(xì)胞的增殖能力受到抑制，Transwell 遷移及侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示癌細(xì)胞的遷移及侵襲能力明顯降低，這些結(jié)果初步認(rèn)定FOXF1在肺癌細(xì)胞中可能扮演了癌基因的角色。本研究還通過Western Blot 實(shí)驗(yàn)對EMT 標(biāo)志物進(jìn)行了檢測，發(fā)現(xiàn)FOXF1 沉默后可抑制N-cadherin、β-Catenin、Vimentin、Snail 的表達(dá)，并促進(jìn)ZO-1 和E-cadherin的表達(dá)，表明FOXF1 沉默后癌細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化受到了抑制。

目前對FOXF1 在NSCLC 中的作用機(jī)理研究并不多，本實(shí)驗(yàn)在NSCLC 細(xì)胞系中直接調(diào)控FOXF1的表達(dá)，初步評估了FOXF1 在調(diào)節(jié)NSCLC 腫瘤細(xì)胞生長、遷移、侵襲中的作用，判斷FOXF1 的表達(dá)能促進(jìn)癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。本實(shí)驗(yàn)組發(fā)現(xiàn)A549肺癌細(xì)胞系中FOXF1 基因表達(dá)水平較低，下一步可在A549 細(xì)胞系中過表達(dá)FOXF1，正反驗(yàn)證FOXF1 表達(dá)對NSCLC 細(xì)胞增殖、侵襲能力的影響，進(jìn)一步說明該條通路的作用。

有研究發(fā)現(xiàn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化與非小細(xì)胞肺癌放療敏感性相關(guān)［20］，未來筆者將嘗試探討FOXF1 表達(dá)與NSCLC 細(xì)胞放療敏感性的關(guān)系。而循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTCs）是近年的熱門研究方向，CTCs 是腫瘤轉(zhuǎn)移的主要途徑，可以反映腫瘤細(xì)胞在特定疾病階段的異質(zhì)性［21-22］，本實(shí)驗(yàn)組希望通過CTCs 捕獲聯(lián)合原代腫瘤干細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，研究FOXF1 基因與循環(huán)腫瘤細(xì)胞、腫瘤干細(xì)胞特性之間的關(guān)系，進(jìn)一步闡明FOXF1 在肺癌發(fā)生發(fā)展過程中扮演的重要作用及相關(guān)機(jī)制。