王靜安 李耀國,2 趙 鑫 金生振 陳開健, 2 肖調(diào)義,2

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)湖南省特色水產(chǎn)資源利用工程技術(shù)研究中心,長沙 410128;2.水產(chǎn)高效健康生產(chǎn)湖南省協(xié)同創(chuàng)新中心,常德 415000)

當(dāng)宿主細(xì)胞受到病毒感染時(shí),機(jī)體會(huì)啟動(dòng)先天性免疫保護(hù)系統(tǒng)產(chǎn)生干擾素(IFN)來抵御病毒的入侵。IFN并不能直接與病毒相互作用,而是通過誘導(dǎo)一系列抗病毒基因的表達(dá)來行使抗病毒作用。在IFN誘導(dǎo)的眾多抗病毒基因中,Mx基因就是具有直接抗病毒活性的重要因子之一[1]。Mx基因是由Ⅰ型干擾素(IFN-Ⅰ)通過IFNα/β和受體之間的結(jié)合,激活JAK-STATs信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑而產(chǎn)生的最終效應(yīng)因子,并通過自身GTP酶的水解作用降解病毒[2]。Mx基因首先是在1962年,Lindenmann等[3]在研究A2G小鼠對(duì)流感病毒耐受性這一現(xiàn)象時(shí)發(fā)現(xiàn)的。隨后,Mx基因在人(Homo sapiens)[4],其他哺乳動(dòng)物[5,6]、禽類[7,8]、魚類[9]等相繼被發(fā)現(xiàn)并克隆出來,并具有較強(qiáng)的抗病毒活性。

在魚類中有多種Mx基因存在,如斑馬魚(Danio rerio)[10]存在7種Mx,被命名為MxA—MxG;斑點(diǎn)叉尾鮰(Ictalurus punctatus)[11]存在5種Mx;在虹鱒(On-corhynchus mykiss)[12]、大西洋鮭(Salmo salar)[13]和草魚(Ctenopharyngodon idella)[14]等魚類中發(fā)現(xiàn)3種Mx;在鯽(Carassius auratus)[15]、大比目魚(Hippoglossus hippoglossus)[16]、大菱鲆(Scophthalmus maximus)[17]中發(fā)現(xiàn)2種Mx;在牙鲆(Paralichthys olivaceus)[18]、稀有鯽(Gobiocypris rarus)[19]、青魚(Mylopharyngodon piceus)[20]等魚類中也有報(bào)道,但魚類Mx基因的不同亞型還沒有系統(tǒng)分類。研究表明,魚類Mx基因能夠在IFN-I、多種病毒、細(xì)菌或干擾素誘生劑(poly I: C)等[21,22]的誘導(dǎo)下表達(dá),反過來高表達(dá)的Mx基因也能夠有效抑制病毒。大西洋鮭Mx1在大鱗大馬哈魚(Oncorhynchus tshawytscha)胚胎細(xì)胞系中過表達(dá),能夠顯著降低傳染性胰臟壞死病毒(Infectious Pancreatic Necrosis Virus,IPNV)復(fù)制[13];草魚3個(gè)Mx在草魚腎細(xì)胞系中過表達(dá),均可顯著減少草魚呼腸孤病毒(Grass Carp Reovirus,GCRV)[14]轉(zhuǎn)錄。

赤眼鱒(Squaliobarbus curriculus)具有對(duì)環(huán)境較強(qiáng)的適應(yīng)性和抗病力,是抗病育種研究的良好材料[23]。因此,本團(tuán)隊(duì)一直致力于赤眼鱒的抗病毒機(jī)理研究,希望能夠在草魚抗GCRV育種中得到應(yīng)用[24,25]。此前,本團(tuán)隊(duì)已經(jīng)在赤眼鱒體內(nèi)克隆出1個(gè)Mx基因(ScMx),并證明了ScMx能夠在抵抗GCRV感染中發(fā)揮重要作用[26]。魚類存在多種Mx基因,是否暗示著赤眼鱒也存在其他Mx基因,也能發(fā)揮抗病毒作用? 因此,本研究以赤眼鱒為材料,克隆了赤眼鱒Mx同源基因,命名為ScMx1,并結(jié)合ScIFN-Ⅰ對(duì)其在GCRV感染條件下的表達(dá)特征進(jìn)行了檢測,為深入研究赤眼鱒抗病毒先天性免疫反應(yīng)信號(hào)通路提供分子基礎(chǔ),也為后續(xù)進(jìn)一步研究赤眼鱒2個(gè)Mx基因的抗病毒差異性及兩者的抗病毒機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)用1+齡(12.80±1.54) g赤眼鱒由瀏陽烏龍漁場提供,實(shí)驗(yàn)前將其暫養(yǎng)于室內(nèi)循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng),設(shè)置水溫為28℃,模擬晝夜規(guī)律定時(shí)光照,每天早晚投喂膨化飼料2次。實(shí)驗(yàn)用GCRV-106病毒毒株由中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所曾令兵研究員提供,病毒滴度為1.78×107TCID50/mL。

1.2 總RNA提取和cDNA合成

參照E.Z.N.A.Total RNA Kit II (Omega,美國)用戶手冊,提取赤眼鱒總RNA;使用1%瓊脂糖凝膠電泳和BioSpectrometer Basic核酸蛋白儀(Eppendorf,德國)檢測RNA質(zhì)量;參照Revert Aid First Strand cDNA Synthesis kit (Fermentas,美國)用戶手冊合成cDNA第一鏈,用于ScMx1中間序列克隆和熒光定量分析;參照SMARTer RACE 5′/3′ cDNA Kit Components (Clontech,美國)用戶手冊合成5′-RACE Ready cDNA和3′-RACE Ready cDNA,用于ScMx1 5′/3′末端序列克隆。

1.3 ScMx1全長cDNA克隆

首先參考草魚Mx基因序列(GenBank登錄號(hào):HQ839769.1),利用primer premier 6.0軟件設(shè)計(jì)引物Mx1-F和Mx-R,用于擴(kuò)增ScMx1基因中間序列。PCR反應(yīng)體系: 10×PCR Buffer 5.0 μL,dNTP Mixture (2.5 mmol/L) 4.0 μL,cDNA 2 μL,Mx1-F (20 μmol/L) 1 μL,Mx1-R (20 μmol/L) 1 μL,TaKaRaTaq(5 U/μL) 0.25 μL,加ddH2O補(bǔ)足至50 μL。反應(yīng)程序: 94℃預(yù)變性5min;94℃ 30s,56℃ 30s,72℃2min,30個(gè)循環(huán);72℃再延伸7min。再根據(jù)已獲得的ScMx1中間序列,設(shè)計(jì)外引物Mx1-5W/3W和內(nèi)引物Mx1-5N/3N,進(jìn)行巢式PCR反應(yīng),用于擴(kuò)增ScMx1基因5′/3′末端序列。第一輪PCR,以5′/3′-RACE-Ready cDNA為模板,以Mx1-5W/3W和UPM Long Primer為引物,退火溫度為68℃。第二輪PCR,以第一輪PCR產(chǎn)物稀釋50倍為模板,以Mx1-5N/3N和UPM Short Primer為引物,退火溫度為62℃。巢式PCR反應(yīng)體系和程序同中間序列克隆。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測并純化,使用pGEM-T載體進(jìn)行TA克隆,送武漢奧科鼎盛生物科技有限公司進(jìn)行測序驗(yàn)證?？寺〉玫降腗x1全長cDNA序列使用引物Mx1-OF/OR進(jìn)行驗(yàn)證。引物如表1。

1.4 ScMx1生物信息學(xué)分析

ScMx1序列拼接使用DNASTAR軟件下的子程序SeqMan,序列相似性使用BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)比對(duì),氨基酸序列翻譯使用ExPASy-Translate tool (https://web.expasy.org/translate/),蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量和等電點(diǎn)計(jì)算使用ExPASy-Compute pI/Mw tool (https://web.expasy.org/compute_pi/),蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測使用SMART (https://www.predictprotein.org/),系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建使用MEGA 5.10軟件(鄰接法),三級(jí)結(jié)構(gòu)同源建模使用I-TASSER (https://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/ITASSER/)。

表 1 本研究所用到的引物Tab.1 Primer sequences used in the research

1.5 組織表達(dá)分析

ScMx1健康組織表達(dá)分析分別采集5尾赤眼鱒的鰓、肝臟、脾臟、體腎、頭腎、腸、心臟、腦、肌肉、皮膚10個(gè)組織,并進(jìn)行RNA提取和逆轉(zhuǎn)錄。選用β-actin和EF1α作為內(nèi)參基因,各基因的熒光定量檢測引物見表1。熒光定量PCR反應(yīng)體系: SYBR Premix ExTaqII 5 μL,cDNA 1 μL,上、下游引物各0.4 μL,加ddH2O補(bǔ)足至10 μL。反應(yīng)程序: 95℃ 30s;95℃ 5s,60℃ 40s,共40個(gè)循環(huán)。使用CFX manager software 3.1 (Bio-Rad,美國)軟件收集和分析基因表達(dá)量數(shù)據(jù)(2-??Ct法),采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析,計(jì)算每組(5個(gè)平行)基因表達(dá)量均值和標(biāo)準(zhǔn)誤,通過GraphPad Prism 6.01軟件作圖,P＜0.05表示各組之間具有顯著性差異。

GCRV感染后ScMxⅠ和ScIFN-I的組織表達(dá)分析將赤眼鱒隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組,30尾/組。實(shí)驗(yàn)組每尾腹腔注射200 μL GCRV-106病毒懸液,對(duì)照組注射等量無菌PBS。處理后6h、12h、24h、72h和168h五個(gè)時(shí)間點(diǎn),每組采集5尾赤眼鱒肝臟、脾臟、體腎和頭腎4個(gè)組織。熒光定量PCR操作及數(shù)據(jù)分析同上。此外,將攻毒后ScMx1和ScIFN-Ⅰ的表達(dá)量進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析,P＜0.05表示具有顯著性意義。

2 結(jié)果

2.1 ScMx1基因cDNA全長序列及結(jié)構(gòu)分析

ScMx1基因cDNA全長為3000 bp (GenBank登錄號(hào)為MH016251),包括5′非編碼區(qū)124 bp,開放閱讀框(ORF) 1893 bp,3′非編碼區(qū)983 bp,編碼630個(gè)氨基酸。預(yù)測ScMx1蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為71.36 kD,理論等電點(diǎn)為5.26。SMART預(yù)測ScMx1蛋白存在3個(gè)典型結(jié)構(gòu): GTP酶結(jié)合區(qū)域(Dynamin GTPase domain: 13—256 aa)、中央核心結(jié)構(gòu)域(Dynamin central domain: 226—513 aa)和GTP酶效應(yīng)結(jié)構(gòu)域(Dynamin GTPase effector domain,GED: 539—630 aa)(圖1A)。此外,ScMx1在GTP酶結(jié)構(gòu)域中含有一個(gè)三聯(lián)體GTP結(jié)合區(qū)域(GDQSSGKS、DLPG和TKPD)和一個(gè)動(dòng)力蛋白信號(hào)(LPRGSGIVTR),在GED的C端含有亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu),這些序列在其他物種Mx中均存在。I-TASSER構(gòu)建的ScMx1蛋白3D模型存在19個(gè)α-螺旋和7個(gè)β-折疊,且β-折疊全部位于GTP酶結(jié)合區(qū)域內(nèi)(圖1B)。

圖1 ScMx1蛋白結(jié)構(gòu)域及3D結(jié)構(gòu)預(yù)測圖Fig.1 Schematic diagram and prediction for the 3D structure of ScMx1

2.2 ScMx1相似性比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化分析

將赤眼鱒Mx1氨基酸序列進(jìn)行BLAST比對(duì),結(jié)果顯示: 赤眼鱒Mx1氨基酸序列與草魚Mx3、青魚Mx1的相似性最高(97%),其次是草魚Mx1 (95%),與鯽Mx1、斑馬魚MxA/MxB的相似性在84%以上,與斑點(diǎn)叉尾鮰Mx1、日本鰻鱺Mx1、鳙鰈Mx等其他魚類Mx的相似性為69%—74%,與人、小家鼠、牛的Mx1/Mx2的相似性為50%—55%,而赤眼鱒Mx1與赤眼鱒Mx、草魚Mx2、鯽Mx2、斑馬魚MxC/MxE的相似性僅49%—50%。將ScMx1和其他物種Mx的氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,結(jié)果顯示: 整個(gè)系統(tǒng)進(jìn)化樹分為兩大支,魚類單獨(dú)聚為一支,爬行類、鳥類和哺乳類聚為一支;在魚類中,又分為三個(gè)亞支,赤眼鱒Mx1和青魚Mx1、草魚Mx1/Mx2等鯉科魚類Mx聚為一個(gè)亞支,大西洋鮭、虹鱒等其他魚類Mx聚為一個(gè)亞支,而ScMx、鯽Mx2、草魚Mx2等鯉科魚類Mx單獨(dú)分化為一個(gè)亞支(圖2)。

2.3 ScMx1的組織表達(dá)

利用熒光定量PCR技術(shù)檢測了ScMx1在赤眼鱒10個(gè)不同健康組織中的表達(dá)情況,結(jié)果顯示: 赤眼鱒Mx1基因在脾臟中的相對(duì)表達(dá)量最高,其次是心臟,在腸和肝臟中的表達(dá)量較低,在肌肉、腦、鰓、體腎等組織中均有表達(dá)(圖3)。

圖2 ScMx1氨基酸序列與其他物種構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic relationship of ScMx1 with other species

2.4 GCRV感染后ScMx1和ScIFN-I的時(shí)序表達(dá)

ScMxⅠ和ScIFN-Ⅰ在肝臟中的時(shí)序表達(dá) 與

PBS組相比,感染GCRV后肝臟中ScMx1和ScIFN-Ⅰ基因表達(dá)量顯著上調(diào)(P＜0.05),但兩者表達(dá)趨勢不太一致。ScMxⅠ表達(dá)量在所檢測的時(shí)間點(diǎn)內(nèi)持續(xù)上調(diào)(圖4A),而ScIFN-Ⅰ表達(dá)趨勢表現(xiàn)為先升高后降低,在72h時(shí)達(dá)到峰值(圖4B);此外,ScMx1表達(dá)量在72h時(shí)急速上升,而ScIFN-I表達(dá)量急速下降,兩者呈相反的趨勢。

ScMxⅠ和ScIFN-Ⅰ在脾臟中的時(shí)序表達(dá)與PBS組相比,感染GCRV后脾臟中ScMx1和ScIFN-Ⅰ的表達(dá)量顯著上調(diào)(P＜0.05),表達(dá)趨勢呈現(xiàn)為先升高后降低,其表達(dá)量均在72h時(shí)達(dá)到峰值。但ScMx1(圖5A)上調(diào)和下調(diào)表達(dá)趨勢比ScIFN-Ⅰ (圖5B)更顯著,且ScMx1比ScIFN-Ⅰ的總體表達(dá)量明顯要高。Pearson相關(guān)性分析結(jié)果表明攻毒后ScMx1和ScIFN-Ⅰ之間的表達(dá)量存在極強(qiáng)相關(guān)性(r=0.94,P=0.018)。

ScMxⅠ和ScIFN-Ⅰ在體腎中的時(shí)序表達(dá)與PBS組相比,感染GCRV后體腎中ScMx1和ScINF-Ⅰ的表達(dá)量顯著上調(diào)(P＜0.05),但兩者表達(dá)趨勢不太一致。ScMx1表達(dá)量在所檢測的時(shí)間點(diǎn)內(nèi)持續(xù)上調(diào)(圖6A),而ScIFN-Ⅰ表達(dá)趨勢表現(xiàn)為先升高后降低,在24h達(dá)到峰值(圖6B),可見兩者在24h后出現(xiàn)相反的表達(dá)趨勢。此外,ScMx1比ScIFN-Ⅰ的總體表達(dá)量明顯要高。

ScMxⅠ和ScIFN-Ⅰ在頭腎中的時(shí)序表達(dá)與PBS組相比,感染GCRV后頭腎中ScMxⅠ和ScIFNI的表達(dá)量顯著上調(diào)(P＜0.05),表達(dá)趨勢呈現(xiàn)為先升高后降低,其表達(dá)量均在72h時(shí)達(dá)到峰值。但ScMxⅠ (圖7A)上調(diào)表達(dá)趨勢比ScIFN-Ⅰ (圖7B)更顯著,而且在168h時(shí)仍顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)。此外,ScMx1比ScIFN-Ⅰ的總體表達(dá)量要高。

圖3 ScMxⅠ在赤眼鱒10個(gè)健康組織中的表達(dá)Fig.3 The relative expressions of ScMxⅠ in 10 different tissues

圖4 GCRV感染后ScMxⅠ和ScIFN-Ⅰ在肝臟中的時(shí)序表達(dá)Fig.4 Expression analysis of ScMxⅠ and ScIFN-Ⅰ in liver after challenged with GCRV

3 討論

在進(jìn)化過程中,魚類Mx基因可分化成多個(gè)分型。本研究克隆得到的赤眼鱒ScMx1與ScMx的相似性僅為50%,甚至低于ScMx1與哺乳動(dòng)物Mx的相似性(50%—55%)。類似的結(jié)果也發(fā)生在草魚的3個(gè)Mx基因(CiMx)間,CiMx1、CiMx3與CiMx2的相似性只有49.2%和49.5%[14]。鯽的2個(gè)Mx的相似性也很低,鯽Mx1與斑馬魚MxA有85%的相似性,而Mx2與斑馬魚MxE有80%的相似性[15]。根據(jù)氨基酸序列的同源性高低鯉科魚類的Mx基因被分成2類,系統(tǒng)進(jìn)化樹也揭示鯉科魚類Mx進(jìn)化成2個(gè)亞支。在鯉科魚類Mx基因的這種分類現(xiàn)象是否意味著同源性較低的Mx,其抵抗病毒的能力和專一性存在差異? 這是很有意思的現(xiàn)象,值得深入研究。此外,先天性免疫系統(tǒng)是魚類重要的防御體系[27],魚類中存在多個(gè)Mx基因,也可能是魚類在進(jìn)化過程中以適應(yīng)復(fù)雜外界環(huán)境的體現(xiàn)。

圖5 GCRV感染后ScMxⅠ和ScIFN-Ⅰ在脾臟中的時(shí)序表達(dá)Fig.5 Expression analysis of ScMxⅠ and ScIFN-Ⅰ in spleen after challenged with GCRV

圖6 GCRV感染后ScMxⅠ和ScIFN-Ⅰ在體腎中的時(shí)序表達(dá)Fig.6 Expression analysis of ScMxⅠ and ScIFN-Ⅰ in trunk kidney after challenged with GCRV

圖7 GCRV感染后ScMxⅠ和ScIFN-Ⅰ在頭腎中的時(shí)序表達(dá)Fig.7 Expression analysis of ScMxⅠ and ScIFN-Ⅰ in head kidney after challenged with GCRV

赤眼鱒Mx1基因編碼的蛋白結(jié)構(gòu)高度保守,與其他魚類Mx蛋白結(jié)構(gòu)一樣,均具有動(dòng)力蛋白超家族典型的結(jié)構(gòu)特征: N端的GTP酶結(jié)合區(qū)域(含三聯(lián)體GTP結(jié)合區(qū)域和動(dòng)力蛋白信號(hào))、中央核心結(jié)構(gòu)域以及C端的GTP酶效應(yīng)結(jié)構(gòu)域(含亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu))。這些結(jié)構(gòu)和位點(diǎn)均與Mx發(fā)揮抗病毒作用密切相關(guān),三聯(lián)體GTP結(jié)合區(qū)域已被證實(shí)是Mx蛋白發(fā)揮GTP酶水解作用和行使抗病毒功能所必須的結(jié)構(gòu)[28];C端亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)能夠介導(dǎo)Mx聚合形成二聚體或三聚體結(jié)構(gòu),與GTP酶效應(yīng)區(qū)的活化和功能協(xié)調(diào)有關(guān)[29]。這些結(jié)構(gòu)區(qū)域在ScMx1蛋白中高度保守,推測ScMx1蛋白同樣具有抵抗病毒和發(fā)揮GTP酶水解的功能。

不同魚類Mx或同種魚類的不同Mx,其組織表達(dá)情況存在差異。Peng等[14]發(fā)現(xiàn)在所檢測的草魚的15個(gè)組織中,CiMx1、CiMx2和CiMx3在鰓和頭腎中高表達(dá),在眼睛和肌肉中少量表達(dá),在皮膚中無表達(dá)。彭慧珍等[26]發(fā)現(xiàn)赤眼鱒ScMx在肝臟中高表達(dá),脾臟次之,在腸中低表達(dá)。而本研究檢測的ScMx1在脾臟中高表達(dá),心臟次之,腸和肝臟中低表達(dá)。赤眼鱒2個(gè)Mx基因的組織表達(dá)分布情況有所差異,預(yù)示著兩者發(fā)揮抗病毒功能的組織特異性?？偟膩碚f,Mx基因在脾臟和頭腎等魚類主要免疫組織[30]中都有較高表達(dá),這也暗示Mx基因與魚類免疫系統(tǒng)密切相關(guān)。魚類Mx基因的抗病毒研究也有報(bào)道,Peng等[14]用GCRV感染草魚后,3個(gè)CiMx和CiIFN-Ⅰ的表達(dá)量在脾臟、頭腎和鰓中均顯著上調(diào)。彭慧珍等[26]用GCRV感染赤眼鱒后,ScMx表達(dá)量在肝和腎中也顯著高于對(duì)照組,呈現(xiàn)為先上升后下降的表達(dá)趨勢,在48h時(shí)達(dá)到峰值。在本研究中,GCRV感染赤眼鱒,同樣能夠檢測到ScMx1和ScIFN-Ⅰ在肝臟、脾臟、體腎和頭腎4個(gè)組織中的上調(diào)表達(dá)。以上結(jié)果符合病毒刺激下由IFN-Ⅰ誘導(dǎo)Mx表達(dá)的抗病毒機(jī)理[2]。本研究在脾臟和頭腎中,ScMx1和ScIFN-Ⅰ均在感染后72h時(shí)出現(xiàn)峰值,并且脾臟中兩者的表達(dá)量存在顯著相關(guān)性,推測ScMx1受ScIFN-Ⅰ調(diào)節(jié)。但在肝臟和體腎中,ScMx1與ScIFN-Ⅰ的表達(dá)趨勢不同,ScMx1持續(xù)上調(diào),ScIFN-Ⅰ則在感染后72h后下調(diào)表達(dá),推測ScMx1與ScIFN-Ⅰ之間可能存在負(fù)反饋調(diào)節(jié)。在不同的組織中,ScMx1和ScIFN-Ⅰ具有不同的表達(dá)特征,這表明ScMx1和ScIFN-Ⅰ之間的相互作用可能存在組織特異性?？傊?赤眼鱒ScMx1與ScIFN-Ⅰ基因可能參與了抗GCRV免疫應(yīng)答反應(yīng),但ScMx1和ScIFN-Ⅰ之間的作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究。