何喜，王志強，林韜

作者單位：唐山市人民醫(yī)院胸外科，河北 唐山063001

食管鱗癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響食管癌預后的主要因素之一，區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移被認為是食管癌病人術后預后不良的指標之一［1］。課題組前期采用免疫組織化學染色方法，發(fā)現(xiàn)血清應答因子（serum response factor，SRF）在食管癌組織中高表達，且與浸潤深度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移關系密切，與α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）的高表達呈正相關；體外研究也顯示基因沉默SRF能夠抑制Eca-109細胞的增殖和侵襲［2］。SRF轉(zhuǎn)錄因子能夠與α-SMA基因啟動子結(jié)合并促進其轉(zhuǎn)錄，被認為是腫瘤細胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的一個重要指標之一［3］。因此本研究擬觀察SRF在食管癌組織及其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中的差異表達，并觀察其與臨床病理參數(shù)以及α-SMA表達的相關性，為研究食管鱗癌發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移機制提供一定的理論基礎和實驗依據(jù)。

1 資料及方法

1.1一般資料收集2017年1月至2018年12月在唐山市人民醫(yī)院行食管癌根治性手術的病人樣本68例，均伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。其中男性46例，女性22例；年齡≥65歲30例，＜65歲38例；腫瘤直徑≥3 cm 36例，腫瘤直徑＜3 cm 32例。按照食管癌國際TNM分期標準（第8版），鱗癌臨床TNM分期I+II期14例，III期54例；浸潤深度T1+T2 12例，T3+T4 56例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移N1為10例，N2+N3為58例。所有標本均經(jīng)蘇木素伊紅染色后病理證實，臨床資料完整。所有病人術前均未行放化療治療。病人或近親屬對研究方案簽署知情同意書。本研究符合《世界醫(yī)學協(xié)會赫爾辛基宣言》相關要求。

1.2方法

1.2.1 HE染色 石蠟切片脫蠟至水，蘇木素10 min，鹽酸酒精分化數(shù)秒，稍洗，伊紅1～2 min，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。

1.2.2 免疫組織化學染色 石蠟切片脫蠟至水，高壓修復，3%H2O2去除內(nèi)源性過氧化物酶，SRF（sc-335，美國santa cruz公司）、α-SMA（ab124964，英國abcam公司）一抗（1：200）4℃過夜，二抗37℃孵育20 min，DAB顯色，蘇木素輕度復染，中性樹膠封固。陽性結(jié)果判定標準：SRF主要表達于細胞核，α-SMA表達主要位于細胞質(zhì)。參照文獻方法判定、分析免疫組織化學染色結(jié)果［2］，即染色強度評分：0（無表達）、1（弱表達）、2（中等程度表達）、強表達（3）；染色百分比評分：0（＜10%）、1（10-30%）、2（31-70%）、3（＞70%）。以染色強度評分與染色百分比評分乘積作為免疫組織化學染色評判結(jié)果，其中≤3分定義為陰性，＞3分定義為陽性。

1.3統(tǒng)計學方法采用SPSS 13.0統(tǒng)計學軟件，組間計數(shù)資料比較采用χ2檢驗。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 SRF、α-SMA在食管癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織中高表達SRF主要表達于細胞核；α-SMA主要表達于細胞質(zhì)，其中在平滑肌組織中的陽性表達不定義為陽性結(jié)果。在食管鱗癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織中的SRF、α-SMA陽性表達率分別為73.53%和77.94%，顯著高于原位癌組的52.94%和44.12%，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見圖1、表1。

表1 SRF、α-SMA在食管癌原位癌組織和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織中的差異表達∕例

2.2 SRF、α-SMA在食管鱗癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌中的表達與臨床病理特征的聯(lián)系SRF、α-SMA在食管鱗癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌標本中的表達與性別、年齡、腫瘤大小無關（P＞0.05），而與浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移區(qū)域和TNM分期關系密切（P＜0.05）。SRF與α-SMA在食管鱗癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌中共表達45例，二者具有正相關性（r＝0.485，P＜0.001）。見表2。

3 討論

SRF作為MADS基因家族的成員之一，可能調(diào)控200多個相應的靶基因，在胚胎發(fā)育、肌肉、消化系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)的形成，以及腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起到了重要的調(diào)控作用［4］。在體內(nèi)外沉默SRF，能夠顯著抑制腫瘤細胞的遷移和侵襲，并抑制荷瘤小鼠的生長，與腫瘤的惡性轉(zhuǎn)移關系密切［3］。其他研究也顯示，SRF在肝癌組織中高表達，其可結(jié)合微小染色體維持蛋白7啟動子并促進其轉(zhuǎn)錄，抑制SRF能夠顯著抑制肝腫瘤干細胞的形成和相關基因的表達［5］?；蚯贸齋RF能夠下調(diào)早期生長反應1蛋白的表達，從而抑制宮頸癌細胞增殖、侵襲和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化［6］。在本研究中也發(fā)現(xiàn)，SRF在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織中的陽性率顯著高于原位癌組織，并與浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移區(qū)域、遠處轉(zhuǎn)移和TNM分期關系密切，提示SRF可能是調(diào)控食管鱗癌轉(zhuǎn)移的一個重要的轉(zhuǎn)錄因子。

表2 SRF、α-SMA在食管鱗癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌中的表達與臨床病理參數(shù)的關系

SRF能夠與α-SMA基因啟動子結(jié)合并促進其轉(zhuǎn)錄，多項研究證實SRF通過對E-鈣黏蛋白、β-連環(huán)蛋白、α-SMA等上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化指標的調(diào)節(jié)，從而促進了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，或在纖維化進程中起到重要的調(diào)控作用［2，7-9］。課題組較早就將α-SMA作為腫瘤細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的指標進行研究，在本研究中也發(fā)現(xiàn)，α-SMA除可以標記腫瘤相關成纖維細胞［10］以外，在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌中陽性表達無論是強度還是陽性表達率，顯著高于原位癌組織。α-SMA在食管癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌中的異常高表達，提示食管癌細胞可能經(jīng)歷上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，從而獲得了遷移和運動的能力，因而促進了腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。然而本研究屬于半定量、描述性研究，在后續(xù)實驗中，將采用免疫印跡和PCR技術定量檢測SRF及α-SMA蛋白和基因水平的差異表達，以期可將SRF作為早期預測食管鱗癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的標記物進行深入研究。

圖1 血清應答因子、α-平滑肌肌動蛋白在食管鱗癌原位癌及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織中的陽性表達