李艷紅，楊亞莉，陳芬，萬翔，龔芳

作者單位：1長江大學(xué)附屬仙桃市第一人民醫(yī)院，a心電圖室，b心內(nèi)科，湖北 仙桃433000；2華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院心內(nèi)科，湖北 武漢430022；3襄陽市中心醫(yī)院，湖北文理學(xué)院附屬醫(yī)院心內(nèi)科，湖北 襄陽441021

心血管疾?。╟ardiovascular diseases，CVDs）是世界范圍內(nèi)常見的高病死率疾病，嚴(yán)重威脅人們的生命健康［1］。與男性相比，女性病人的發(fā)病年齡雖然較晚，但病死率及并發(fā)癥的發(fā)生率均高于男性［2］。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)絕經(jīng)前女性心血管疾病發(fā)病率較低，絕經(jīng)后明顯增高，這是由于女性體內(nèi)的雌激素可以影響血脂代謝，對(duì)心血管系統(tǒng)具有一定的保護(hù)作用［3-4］。此外，有研究指出在時(shí)間窗口期應(yīng)用雌激素對(duì)心血管系統(tǒng)具有保護(hù)作用。但是，也有研究［5-6］發(fā)現(xiàn)應(yīng)用口服雌孕激素替代治療對(duì)心血管并沒有保護(hù)作用。因此，關(guān)于雌激素對(duì)心血管系統(tǒng)的作用引起廣泛的關(guān)注，成為目前研究的熱點(diǎn)。本研究2019年1—3月通過篩選雌激素作用后的差異基因，進(jìn)一步明確雌激素在心血管系統(tǒng)中的調(diào)控靶點(diǎn)及作用網(wǎng)絡(luò)，從而為進(jìn)一步明確雌激素在心血管系統(tǒng)中的作用提供方向。

1 資料與方法

1.1數(shù)據(jù)檢索通過NCBIGEODatasets檢索雌激素在心血管中的相關(guān)研究，篩選出GSE9371數(shù)據(jù)集［7］。該數(shù)據(jù)來源于美國波士頓大學(xué)生物部門Hansens實(shí)驗(yàn)室，研究者將小鼠分為安慰劑組與雌激素組，每組5個(gè)重復(fù)，在接受長期（1周）的雌激素治療后，提取了小鼠主動(dòng)脈組織中的總RNA進(jìn)行了基因表達(dá)譜分析，以確定長期雌激素治療對(duì)綜合基因組的表達(dá)的調(diào)控。樣本數(shù)據(jù)信息見表1。

表1 雌激素在心血管中的相關(guān)研究GSE9371數(shù)據(jù)樣本信息

1.2差異表達(dá)基因分析采用NCBIGEO2R在線分析工具［8］進(jìn)行差異表達(dá)基因的分析，以安慰劑組為對(duì)照組，雌激素組為干預(yù)組。將差異表達(dá)倍數(shù)大于2倍，同時(shí)P＜0.05的基因篩選為差異表達(dá)基因。

1.3 GO富集分析及作圖采用DAVID 6.8從生物學(xué)過程，細(xì)胞組分和分子功能三個(gè)方面進(jìn)行GO富集分析［9］，以P＜0.05篩選為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的GO富集結(jié)果。采用R語言ggplot2程序包進(jìn)行可視化繪圖。

1.4通路富集分析及作圖采用DAVID 6.8在REACTOME，BIOCARTA，KEGG_pathway三個(gè)通路數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行KEGG富集分析［9］，以P＜0.05篩選為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的通路富集結(jié)果。采用R語言ggplot2程序包進(jìn)行可視化繪圖［10］。

1.5蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析采用STRING數(shù)據(jù)庫［11］對(duì)篩選出的差異基因進(jìn)行蛋白質(zhì)相互作用的分析，隱藏不存在相互作用的節(jié)點(diǎn)，最小相互作用證據(jù)評(píng)分設(shè)置為0.4分。此外，采用R語言統(tǒng)計(jì)與其它蛋白相互作用關(guān)系最多的節(jié)點(diǎn)，取前30個(gè)進(jìn)行可視化作圖。采用Cytoscape中的MCODE算法分析［12］，提取其中的核心基因模塊，同樣利用DAVID 6.8對(duì)核心模塊基因進(jìn)行GO富集分析及通路富集分析。

2 結(jié)果

2.1差異表達(dá)基因的分析將雌激素組與安慰劑組基因表達(dá)水平進(jìn)行比較，按照差異表達(dá)倍數(shù)大于2倍，同時(shí)P＜0.05進(jìn)行差異表達(dá)基因的篩選，共篩選到差異表達(dá)基因192個(gè)，按照P值排序，其中前10位的基因?yàn)?Grem2、Ano4、Mmd2、Apod、Galnt15、Heph、Vldlr、Stc1、Vwf和Zmiz1，均為上調(diào)表達(dá)（表2）。

表2 雌激素在心血管中的相關(guān)研究中雌激素組與安慰劑組前10位差異表達(dá)基因

2.2基因功能富集分析基因功能富集分析將上述192個(gè)差異基因映射到生物學(xué)過程，細(xì)胞組分和生物學(xué)功能三個(gè)基因功能數(shù)據(jù)庫中，以P＜0.05篩選有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的富集結(jié)果，共篩選到100個(gè)顯著相關(guān)的基因功能條目。其中59個(gè)（59%）條目與生物學(xué)過程有關(guān)，涉及脂代謝過程、巨噬細(xì)胞活化調(diào)控過程、紅細(xì)胞分化、脂肪細(xì)胞分化調(diào)控過程、視黃醇代謝過程、血管生成調(diào)控、細(xì)胞生長調(diào)節(jié)以及細(xì)胞黏附等生物學(xué)功能。20個(gè)（20%）條目與細(xì)胞組分有關(guān)，主要與胞外區(qū)、細(xì)胞外隙、蛋白質(zhì)的細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞外外泌體、線粒體等有關(guān)。21個(gè)（21%）條目與分子功能有關(guān)，涉及的分子功能有Wnt蛋白結(jié)合、肝素結(jié)合、脂質(zhì)結(jié)合、胰島素樣生長因子結(jié)合、RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子活性等有關(guān)。按照P值排序，其中前10位的基因功能富集結(jié)果條目見圖1。

2.3通路富集分析通路富集分析將上述192個(gè)差異基因映射到BBID、BIOCARTA和KEGG_pathway三個(gè)通路數(shù)據(jù)庫中，以P＜0.05篩選有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的富集結(jié)果，共篩選到13個(gè)顯著富集的信號(hào)通路，分別是乙醇氧化信號(hào)通路、PPAR信號(hào)通路、脂肪酸降解信號(hào)通路、視黃醇類代謝和運(yùn)輸信號(hào)通路以及紅細(xì)胞吸收氧氣并釋放二氧化碳信號(hào)通路等有關(guān)，其中前10位的通路富集結(jié)果條目見圖2。

2.4蛋白質(zhì)相互作用分析我們采用STRING數(shù)據(jù)庫對(duì)192個(gè)差異基因進(jìn)行蛋白質(zhì)（基因）互作網(wǎng)絡(luò)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中131個(gè)基因構(gòu)成了互作網(wǎng)絡(luò)（圖3）。對(duì)網(wǎng)絡(luò)中每個(gè)基因的互作基因的個(gè)數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)后發(fā)現(xiàn)，與 Col1a1、Ppargc1a、Cdh2、Ppara、Thbs1等基因存在相互的基因較多，其中前30位的互作基因見圖4。隨后我們使用MCODE算法進(jìn)一步提取了其中的核心子網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)中有5個(gè)核心子網(wǎng)絡(luò)（圖5），對(duì)每個(gè)核心子網(wǎng)絡(luò)的基因進(jìn)行富集分析后發(fā)現(xiàn)，核心子網(wǎng)絡(luò)1主要與細(xì)胞外基質(zhì)、膽固醇平衡、細(xì)胞外間隙、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)以及PPAR信號(hào)通路有關(guān)。核心子網(wǎng)絡(luò)2主要與鈣調(diào)蛋白結(jié)合和胰島素分泌等有關(guān)，核心子網(wǎng)絡(luò)3主要與鐵離子平衡和紅細(xì)胞分化有關(guān)，核心子網(wǎng)絡(luò)4主要與血管新生的調(diào)控有關(guān)，核心子網(wǎng)絡(luò)5主要與生長激素受體信號(hào)通路和Jak-STAT信號(hào)通路有關(guān)（表3）。

3 討論

近年來，我國心血管疾病的發(fā)病率及死亡率均持續(xù)上升，其死亡率居于首位，同時(shí)其在居民死亡的疾病構(gòu)成中占比達(dá)到40%以上，嚴(yán)重威脅居民的生命健康［13］。就性別而言，女性心血管疾病病人的發(fā)病年齡雖然較晚，但病死率及并發(fā)癥的發(fā)生率均高于男性［2］。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)雌激素可以影響血脂代謝，對(duì)心血管系統(tǒng)具有一定的保護(hù)作用［3-4］。既往研究發(fā)現(xiàn)雌激素可以通過多種途徑保護(hù)心血管系統(tǒng)，雌激素可以調(diào)節(jié)平滑肌細(xì)胞的收縮性和基質(zhì)形成，抑制平滑肌和心肌細(xì)胞的凋亡，抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起的凋亡保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞［14-16］。但美國婦女健康倡議活動(dòng)（WHI）研究［6］發(fā)現(xiàn)應(yīng)用口服雌孕激素替代治療對(duì)心血管并沒有保護(hù)作用，甚至?xí)黾咏^經(jīng)后女性患冠心病的風(fēng)險(xiǎn)。因此，關(guān)于雌激素是否可以用于女性心血管疾病的治療以及雌激素對(duì)心血管系統(tǒng)的作用機(jī)制引起廣泛的關(guān)注，成為目前研究的熱點(diǎn)。

表3 核心子網(wǎng)絡(luò)基因功能及通路富集分析結(jié)果

本研究通過對(duì)GEO數(shù)據(jù)庫的挖掘，分析了雌激素作用后血管總RNA中存在顯著差異表達(dá)的基因，通過基因功能與通路富集分析，發(fā)現(xiàn)這些基因的功能與脂代謝過程、巨噬細(xì)胞活化、脂肪細(xì)胞分化、血管生成、線粒體、胰島素樣生長因子等有關(guān)（圖1），涉及的信號(hào)通路有乙醇氧化信號(hào)通路、PPAR信號(hào)通路、脂肪酸降解信號(hào)通路等（圖2）。說明雌激素可能通過這些基因功能與信號(hào)通路影響脂質(zhì)代謝、血管新生以及細(xì)胞生長等生物學(xué)功能。蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)，192個(gè)差異基因中有131個(gè)基因間存在相互作用關(guān)系，構(gòu)成了互作網(wǎng)絡(luò)（圖3）。其中核心的子網(wǎng)絡(luò)有5個(gè)，這些核心子網(wǎng)絡(luò)的功能主要與細(xì)胞外基質(zhì)、膽固醇平衡、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、鈣調(diào)蛋白、胰島素分泌、血管新生、生長激素受體信號(hào)通路和Jak-STAT信號(hào)通路有關(guān)（表3）。核心子網(wǎng)絡(luò)富集到的基因功能與信號(hào)通路與所有基因富集后的結(jié)果基本一致，更加證明了雌激素可能通過這些基因功能與信號(hào)通路對(duì)心血管的功能產(chǎn)生影響。對(duì)上述雌激素對(duì)心血管系統(tǒng)可能的調(diào)控途徑進(jìn)一步分析后發(fā)現(xiàn)，雌激素可能通過調(diào)節(jié)脂代謝［3-4］，促進(jìn)巨噬細(xì)胞活化［17］、促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長［18］，激活胰島素樣生長因子［19］，激活PPAR信號(hào)通路［20］等途徑對(duì)心血管發(fā)揮保護(hù)作用，而其可能通過促進(jìn)脂肪細(xì)胞分化［21］而對(duì)心血管產(chǎn)生一定的危害。這些基因功能或信號(hào)通路可作為后續(xù)進(jìn)一步研究的方向，從而明確雌激素在心血管系統(tǒng)中的作用。

圖1 前10位基因功能富集分析 圖2 前10位信號(hào)通路富集結(jié)果 圖3 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖圖4 前30位蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中存在聯(lián)系的節(jié)點(diǎn)數(shù) 圖5 核心子網(wǎng)絡(luò)圖