盧新喜 羅聰 張秀娟 余海霞 劉源 何新華

摘 ?要：CONSTANS（CO）是光周期途徑的核心調(diào)控因子，其可以整合光質(zhì)和生物鐘輸出的信號調(diào)控植物成花。在前期轉(zhuǎn)錄組研究的基礎上，設計基因特異性引物，通過RT-PCR擴增得到芒果的1個CO基因的cDNA全長，序列長度為678 bp，根據(jù)與擬南芥CO家族基因的相似性，將其命名為MiCOL6。生物信息學分析顯示，該基因編碼226個氨基酸，分子量為26.88 kDa，等電點為4.85，屬于親水性的非分泌蛋白。保守結(jié)構(gòu)域和進化樹分析顯示，該基因僅含1個CCT結(jié)構(gòu)域，屬于CO基因家族的第4組;二級結(jié)構(gòu)分析表明，該蛋白主要以無規(guī)卷曲和α-螺旋為主;亞細胞定位預測顯示該蛋白定位在細胞質(zhì)膜上的概率最大;不同花發(fā)育時期表達模式分析表明，MiCOL6基因在杧果的花芽分化期表達量最高。本研究結(jié)果為進一步研究芒果MiCOL6基因在芒果中的功能提供理論基礎。

關(guān)鍵詞：芒果;CONSTANS;MiCOL6;基因克隆;生物信息學分析;表達模式分析

中圖分類號：S667.7 ? ? ?文獻標識碼：A

Abstract： CONSTANS （CO） is a core regulator of the photoperiod pathway， which integrates light quality and clock output signals to regulate the floral transformation in plants. A full-length cDNA of MiCOL6 gene was obtained from transcriptome data analysis and then verified by RT-PCR amplification in mango. Sequences analysis showed that the open reading frame was 678 bp in length， coding 226 amino， the molecular weight and isoelectric point （pI） of MiCOL6 was 26.88 kDa and 4.85， respectively; and MiCOL6 was a non-secreted hydrophilic protein. Conserved domain and phylogenetic tree analysis showed that MiCOL6 contained only one CCT domain and belonged to the group IV of the CO gene family. The secondary structure analysis showed that the protein mainly consisted of random curl and α-helix. The subcellular localization prediction showed that MiCOL6 was likely to be localized in the cytoplasm membrane. Expression pattern analysis showed that the MiCOL6 was the highest expressed in leaves during the bud differentiation period. The results of the experiment would provide a theoretical basis for the further study on the function of MiCOL6 in mango.

Keywords： mango; CONSTANS; MiCOL6; gene cloning; bioinformatics analysis; expression pattern analysis

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.04.012

CO是光周期途徑中調(diào)控植物開花的重要調(diào)控因子，屬于B-box基因家族[1]。在光周期途徑中CO通過整合生物鐘末端輸出的信號調(diào)節(jié)開花基因FLOWERING LOCUS T （FT） 的表達，進而調(diào)控開花時間[2]。Putterill等[3]首先在擬南芥中分離出CO基因。CONSTANS家族蛋白的特征是在N-末端存在1個或2個鋅指B-box結(jié)構(gòu)域和C-末端含有CCT（CO，CONSTANS-LIKE和TOC1）結(jié)構(gòu)域[3]。系統(tǒng)發(fā)育分析將植物中的COL蛋白分為4大類[4]。第1組COL包含2個B-box結(jié)構(gòu)域，1個CCT結(jié)構(gòu)域和1個額外的VP基序（參與和COP1相互作用的纈氨酸-脯氨酸基序。第2組COL僅包含1個B-box結(jié)構(gòu)域和1個CCT結(jié)構(gòu)域。第3組COL有1個完整的B-box結(jié)構(gòu)域，1個結(jié)構(gòu)發(fā)生變異的B-box結(jié)構(gòu)域和1個CCT域[4-6]。第4組COL不含B-box結(jié)構(gòu)域僅有1個CCT結(jié)構(gòu)域[4]。研究表明，單子葉和雙子葉植物中的COL基因家族有許多成員。例如在擬南芥中有17個[4]，水稻中有16個[4]，大麥中有9個[4]，陸地棉中有42個[7]，梨中有15個[8]，竹子中有15個[9]，玉米中有19個[10]，葡萄中有12個[11]，韭菜中有17個[12]，香蕉中有25個[13]。最近研究表明，CO家族基因在不同植物中的功能有所差異。

目前，在擬南芥中對CO基因家族有了深入的研究，但在多年生木本植物中的研究較少。芒果是重要的熱帶水果，具有重要的經(jīng)濟價值，其開花分子機理研究較少。本研究在該課題組前期研究的基礎上，以‘四季蜜芒為實驗材料，克隆得到MiCOL6基因，并進行生物信息學分析以期對進一步研究芒果MiCOL6基因的生物學功能提供理論基礎。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

供試芒果材料種植于廣西大學農(nóng)學院果樹標本園，克隆樣品為‘四季蜜芒的嫩葉。不同花發(fā)育時期表達分析的材料為2016年11月1日、2016年12月1日、2016年12月30日、2017年2月1日、2017年3月11日的‘四季蜜芒的葉片，2016年11月1日—12月1日為‘四季蜜芒的營養(yǎng)生長期，2016年12月1—30日為‘四季蜜芒的成花誘導期，2016年12月30日—2017年2月1日為‘四季蜜芒的花芽分化期，2017年2月1日—3月11日‘四季蜜芒的花序伸長及開花期。樣品采集后快速冷凍保存于?80 ℃。

DL2000 Marker購自南寧壹顆松;克隆所用超純水、dNTP、酶、瓊脂糖、氨芐青霉素、酵母粉、胰蛋白胨等藥品購自廣州擎科;多糖多酚植物RNA提取試劑盒、膠回收試劑盒、實時熒光定量試劑盒SYBR Premix Dimer Eraser購自廣西天地楊有限公司;引物合成和測序為廣州擎科生物有限公司;其他實驗耗材購于大連寶生物公司。

1.2 ?方法

1.2.1 ?基因克隆 ?以提取芒果總RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板。從芒果轉(zhuǎn)錄組測序中獲取MiCOL6基因序列并了特異性引物MiCOL6u和MiCOLd（表1）進行擴增。25 ?L PCR系統(tǒng)。擴增程序為：95 ℃ 5 min;35個循環(huán)95 ℃ 40 s，55 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min;最后在72 ℃延長10 min，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，根據(jù)檢測結(jié)果用膠回收試劑盒，按照說明回收目標片段，然后將回收到的目標基因片段連接到pMD18-T載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。涂板、挑選和培養(yǎng)單菌落。經(jīng)篩選的陽性克隆被送往上海生工生物技術(shù)有限公司進行測序。

1.2.2 ?生物信息學分析 ?利用MEGA6軟件，采用NJ方法構(gòu)建了COL系統(tǒng)發(fā)育樹;使用DN?A?MAN6.0 軟件將MiCOL6的氨基酸序列其它物種的氨基酸序列進行比對;采用在線分析工具ExPASy-ProtParam（https：//web.expasy.org/pro- ?tpar?am/）分析芒果MiCOL6氨基酸序列的理化性質(zhì);利用Conserved Domains（https：//www.ncbi. nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）工具預測Mi-C?OL6蛋白的保守結(jié)構(gòu)域;使用SignalP 4.1 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）在線軟件對MiCOL6進行信號肽預測;利用TM?H?MM Severv. 2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/ser?vices/ TMHMM-2.0/）在線軟件分析MiCOL6蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域;使用NetPhos 3.1 Serve（http：//www. cbs. dtu.dk/services/NetPhos/）在線工具對MiCOL6蛋白序列潛在磷酸化位點預測分析;通過Ex?PASy（http：//web.expasy.org/prot-scale/）在線軟件對MiCOL6氨基酸親疏水性進行分析;使用SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgibin/np??sa_au??t?o-mat.pl？page=npsa_sopma.htmL）在線軟件分析MiCOL6蛋白二級結(jié)構(gòu);利用PSORT II Prediction在線工具（http：//psort.hgc.jp/form2. html）對Mi?COL6蛋白進行亞細胞定位預測。

1.2.3 ?MiCOL6不同花發(fā)育時期的表達分析 ?根據(jù)基因序列設計熒光定量PCR引物qCOL6u和qCOL6d（表1），定量內(nèi)參基因為芒果的Actin1。Actin的上游和下游引物見表1，實時熒光PCR擴增每個樣重復3次，同時設空白對照和陰性對照。熒光定量儀器為ABI7500型PCR儀。擴增反應程序參照試劑盒SYBR Premix Dimer Eraser（TaKaRa）說明書進行。以50 ?g/L的cDNA為模板，反應體系20 ?L：cDNA 2 ?l，上下游引物0.4 ?L，SYBRⅡ 10 ?L，ROXⅡ 0.4 ?L，超純水6.6 ?L。PCR程序如下：95 ℃ 30 s，Ⅱ95 ℃ 5 s和60 ℃ 34 s 40個循環(huán)，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。qRT-PCR的數(shù)據(jù)分析采用2ΔΔCT法。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?MiCOL6基因克隆

以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA為模板，用基因特異性引物通過RT-PCR法克隆‘四季蜜芒MiCOL6基因，電泳檢測顯示成功獲得1條長度約為700 bp的條帶（圖1）?？寺〗Y(jié)果送去測序，獲得序列長度為678 bp，序列與轉(zhuǎn)錄組獲得的序列一致。

2.2 ?MiCOL6基因生物信息學分析

2.2.1 ?同源性分析及進化樹分析 ?根據(jù)CO基因家族的不同類群，從GenBank下載了擬南芥、毛果楊、可可樹部分COL蛋白序列，利用MEGA6軟件，采用NJ方法構(gòu)建了COL系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2），系統(tǒng)發(fā)育樹表明，這些COL基因可分為4組。第1組有2個保守的B-Box 域和一個CCT域，如AtCOL、AtCOL1和AtCOL2。第2組有1個保守的B-Box域和1個CCT域，比如AtCOL6、AtCOL7和AtCOL16。第3組有1個保守的B-Box域、1個結(jié)構(gòu)發(fā)生變異的鋅指域和1個CCT域，如AtCOL9、AtCOL10、AtCOL11 和AtCOL13。第4組沒有B-Box域，只有1個保守的CCT域，如PtCOL16、TaCOL8和MiCOL6。MiCOL6基因與PtCOL16和TaCOL8基因有密切的遺傳關(guān)系，可聚集到CO基因家族的第4組。

2.2.2 ?氨基酸的序列比對分析 ?將芒果中MiC?OL6的氨基酸序列在NCBI上進行Blast分析，結(jié)果表明MiCOL6蛋白序列與其他植物的COL蛋白序列各基因編碼氨基酸的GenBank登錄號如下：擬南芥AtCOL （NM_121589），AtCOL1 （NM_1215?89），At COL2 （NM_111105），AtCOL6 （NM_1060?47），AtCOL7 （NM_103803），AtCOL9 （AB023039），AtCOL10 （NM_117613），AtCOL11 （NM_113084），AtCOL12 （NM_130356），AtCOL16 （NM_102355）;毛果楊PtCOL16 （XP_024449388），可可樹TaC?O?L8 （XP_007016977）。

具有較高的同源性，MiCOL6蛋白與其他COL蛋白的序列相似性如下：與亞洲棉（XP_017641001），西班牙栓皮櫟（XP_023874898），毛果楊（XP_02444-9388）的同源性分別為60.34%、59.91%、58.77%。

使用DNAMAN 6.0軟件分別將MiCOL6的氨基酸序列與上述物種的氨基酸序列進行對比，結(jié)果表明，MiCOL6氨基酸序列與其他植物的COL蛋白序列都具有保守的CCT結(jié)構(gòu)域（圖3）。

各基因編碼氨基酸的GenBank登錄號如下：毛果楊PtCOL16（XP_ 024449388），栓皮櫧QsCOL7（XP_0238?74898），樹棉GaCOL16（XP_017641001）。

2.2.3 ?一級結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)分析 ?通過在線Prot-Param程序（https：//web.expasy.org/protparam/）對MiCOL6基因進行一級結(jié)構(gòu)分析。結(jié)果顯示該基因編碼的蛋白由226個氨基酸組成（不含色氨酸和半光氨酸殘基）。谷氨酰胺含量最高，共計35個，占氨基酸總數(shù)的15.5%。負電荷殘基（Asp+ Glu）50個，占22.1%，正電荷殘基（Arg+Lys）36個，占15.9%，分子量為26.89 kDa，等電點（pI）為4.85，分子式為 C1184H1835N323O377S8，總原子量為3727，不穩(wěn)定指數(shù)為 63.279（不穩(wěn)定系數(shù)<40 時穩(wěn)定），被歸類為不穩(wěn)定蛋白，GRAVY系數(shù)為?1.077，為親水性蛋白，脂肪族氨基酸指數(shù)為61.68。

2.2.4 ?氨基酸保守結(jié)構(gòu)域分析 ?利用Conserved Domai（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）工具預測MiCOL6蛋白的保守結(jié)構(gòu)域（圖4），結(jié)果顯示MiCOL6基因含有CC保守結(jié)構(gòu)域，利用ScanProsit（http：//prosite.expasy.org/）工具對MiCOL6蛋白進行分析，結(jié)果顯示，MiCOL6氨基酸的第182～224位區(qū)域為CCT保守結(jié)構(gòu)域。

2.2.5 ?氨基酸信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)域分析 ?分別使用SignalP 4.1 Server和TMHMM Severv.2.0在線軟件對MiCOL6進行信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)域預測，結(jié)果（圖5、圖6）顯示MiCOL6蛋白不是信號肽也不存在跨膜結(jié)構(gòu)域。

2.2.6 ?磷酸化位點及疏水性分析 ?使用在線工具NetPhos 3.1 Serve （http：//www.cbs.dtu.dk/services/ NetPhos/）對MiCOL6基因的蛋白序列潛在磷酸化位點預測分析（圖7）。分析結(jié)果顯示，此蛋白含有絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸3種氨基酸的磷酸化位點，共18個，其中絲氨酸（Serine）的磷酸化位點11個，蘇氨酸（Threonine）的磷酸化位點4個，酪氨酸（P-hydroxyphenylalanine）的磷酸化位點3個，其中最有可能是潛在磷酸化位點的是第60位絲氨酸，其值已經(jīng)達到0.992，遠遠超過標準值0.5。

通過在線氨基酸疏水性分析工具（http：//web. exp??asy.org/protscale/）對芒果MiCOL6蛋白氨基酸序列進行分析（圖8）。預測結(jié)果顯示，該蛋白為親水性蛋白，大部分氨基酸表現(xiàn)為親水性，其中第43個氨基酸表現(xiàn)出最大疏水性，為0.667，第93個氨基酸表現(xiàn)出最大親水性，為3.611。

2.2.7 ?MiCOL6蛋白的二級結(jié)構(gòu)及亞細胞定位預測 ?使用SOPMA在線軟件預測MiCOL6蛋白二級結(jié)構(gòu)。預測結(jié)果顯示，該蛋白無規(guī)卷曲占43%，α-螺旋占52%，TM螺旋占14%。

利用PSORT II Prediction在線工具對MiCO?L6蛋白進行亞細胞定位預測。結(jié)果表明，該蛋白在質(zhì)膜上的概率為69.6%，在細胞核上的概率為26.1%，在細胞骨架上的概率為4.3%。

2.3 ?MiCOL6不同花發(fā)育時期的表達分析

對MiCOL6基因在‘四季蜜芒中不同花發(fā)育時期進行表達模式分析，結(jié)果見圖9。由圖9可知：MiCOL6在成花誘導期表達量逐漸上升，在花芽分化初期的相對表達量最高，在花芽分化期的表達量逐步降低與營養(yǎng)生長期的表達量趨于一致，花序伸長及開花期的表達量逐略有升高，但與營養(yǎng)生長期的表達量相差不大，推測該基因在杧果花芽分化過程中起著重要作用。

3 ?討論

近10年來，CO基因得到了廣泛的研究。據(jù)報道，其參與了許多分子和遺傳過程，包括控制光周期反應、開花時間和調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律[14]、光轉(zhuǎn)導[15]等。一些COL家族成員的功能在擬南芥中得到了驗證。對現(xiàn)有擬南芥數(shù)據(jù)庫的檢查顯示，AtCOL在調(diào)節(jié)開花時間，光形態(tài)發(fā)生，生物鐘、根發(fā)育、生長素信號傳導和花青素積累方面發(fā)揮作用[6， 16-19]。在其他植物中，COL家族成員具有不同的特征功能。CO或COL基因在土豆中也可以參與塊莖的形成[20]，梨中PbCOL8通過抑制開花信號因子FT和SOC1的表達進而達到延遲開花[8]，竹子中的PvCO1是其開花的負調(diào)控因子[9]，水稻中CONSTANS-Like 9（OsCOL9）與活化C-激酶1（OsRACK1）的受體相互作用，通過水楊酸和乙烯信號通路調(diào)節(jié)抗稻瘟病性[21]。但關(guān)于芒果中CO家族基因的研究，鮮有報道。

本研究首次克隆得到了芒果的MiCOL6基因，通過生物信息學方法預測分析，MiCOL6基因含有有CO家族成員的CCT保守結(jié)構(gòu)域（圖3），系統(tǒng)進化樹分析表明，MiCOL6與PtCOL16和TaCOL8聚到一類，僅含有CCT保守結(jié)構(gòu)域，這與Robson等[22]報道的CO家族結(jié)構(gòu)特點不同，與徐趁等[23]報道的芒果MiCO基因的結(jié)構(gòu)也不相同，但與Liu等[12]報道的韭菜的部分CO家族基因相同，與小麥中CO-like基因TaCO9[24]基因結(jié)構(gòu)相同，說明芒果中CO家族基因在進化的過程中發(fā)生了進化，屬于CO家族的第4類;氨基酸信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)域結(jié)果表明，MiCOL6蛋白沒有信號肽和跨膜域，說明其不屬于分泌蛋白;磷酸化位點分析結(jié)果顯示，該蛋白共存在18個潛在的磷酸化位點，鑒于磷酸化是調(diào)控蛋白質(zhì)活力與功能的重要途徑[25]，說明MiCOL6蛋白可能通過相應氨基酸位點的磷酸化來實現(xiàn)其功能的調(diào)控;亞細胞定位預測結(jié)果顯示，該蛋白定位在質(zhì)膜上的概率最大，與Wang等[8]報道梨的PbCOL8蛋白定位于細胞核的結(jié)果有所差異。不同花發(fā)育時期表達模式結(jié)果表明，MiCOL6基因在芒果的花芽分化期表達量最高，說明該基因可能在芒果花芽分化過程中發(fā)揮著重要作用。本研究有助于后續(xù)開展研究MiCOL6基因在芒果中的功能。

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