吳成玉，許克慶，葛迅，馬帥，陳小虎，湯義民，金璐，陶鈞

(1.安徽理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院；2.安徽理工大學(xué)第一附屬醫(yī)院暨安徽省淮南市第一人民醫(yī)院骨科，安徽 淮南 232001)

激素性股骨頭缺血性壞死(steroid induced avascular necrosis of the fomoral head，SANFH)的病因是長(zhǎng)期或大劑量的應(yīng)用糖皮質(zhì)激素致使股骨頭骨組織代謝失衡、血供受損或中斷從而導(dǎo)致局部缺血壞死，關(guān)節(jié)面塌陷，甚至骨折[1]。由于糖皮質(zhì)激素在臨床上的用處廣泛，使得激素性股骨頭缺血性壞死成為骨科的多發(fā)病和常見病之一[2]。目前關(guān)于激素性股骨頭缺血性壞死的發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)存在爭(zhēng)議，主要考慮與脂質(zhì)代謝紊亂學(xué)說(shuō)[3-4]、血管內(nèi)凝血學(xué)說(shuō)[5]、骨質(zhì)疏松學(xué)說(shuō)[6]、細(xì)胞自噬學(xué)說(shuō)[7-8]等有關(guān)。因此關(guān)于SANFH的治療也未有統(tǒng)一意見，雖然臨床上非手術(shù)治療和手術(shù)治療均有一定進(jìn)展，但療效仍差強(qiáng)人意。故而關(guān)于激素性股骨頭缺血性的治療急需一種療效確切的治療方法。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factorβ1，TGF-β1)在骨損傷的修復(fù)中起重要作用，既可促進(jìn)成骨細(xì)胞分化[9],又在成骨細(xì)胞向受損區(qū)域的遷移中發(fā)揮重要作用[10]。同時(shí)，TGF-β1亦可抑制破骨細(xì)胞的成熟和破骨細(xì)胞前體的增殖[11]。雖然TGF-β1的骨修復(fù)作用已被廣泛認(rèn)可，但關(guān)于TGF-β1對(duì)激素性股骨頭壞死的療效及作用機(jī)制卻鮮有研究和報(bào)道。本研究通過(guò)建立激素性兔股骨頭壞死模型，應(yīng)用TGF-β1進(jìn)行治療，觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中脂質(zhì)及空骨陷窩的變化、股骨頭組影像學(xué)改變，探討TGF-β1對(duì)激素性股骨頭壞死的療效及作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康成年新西蘭大白兔44只，體重為(2.25 ± 0.25)kg，均為雄性，單籠喂養(yǎng)。動(dòng)物購(gòu)買自南京市江寧區(qū)青龍山動(dòng)物繁殖場(chǎng)，動(dòng)物許可證編號(hào)：SCXK(蘇)2017-0011，由蚌埠醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供并在此完成實(shí)驗(yàn)。

1.2 藥物及試劑

藥物：TGF-β1，25微克/支，購(gòu)于PeproTech，生產(chǎn)批號(hào)：0218209-1 H1318；甲潑尼龍，500毫克/瓶，購(gòu)于Pfizer Manufacturing Belgium NV，進(jìn)口藥品注冊(cè)標(biāo)準(zhǔn) H2017199；大腸桿菌內(nèi)毒素(lipopolysaccharide,LPS),10毫克/支，購(gòu)于Sigma-Aldrich,生產(chǎn)批號(hào) 028M4094V；青霉素鈉，80萬(wàn)單位/支，購(gòu)于中諾藥業(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H13021634。

1.3 分組

44只新西蘭大白兔行生化分析檢查血總膽固醇和甘油三酯，結(jié)果不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w后隨機(jī)分成3組：治療組(18只)，模型組(18只)，空白對(duì)照組(8只)。

1.4 造模和干預(yù)方法

1.4.1 造模 模型組、治療組經(jīng)耳緣靜脈注射LPS，劑量10 μg/kg，每天1次，共注射2次，每次注射間隔24 h。最后一次注射LPS后，間隔24 h，肌肉注射甲潑尼龍，劑量為 25 mg/kg，每天1次，連續(xù)注射3次，每次注射間隔24 h。運(yùn)用此種方法復(fù)制激素性股骨頭壞死。對(duì)照組新西蘭大白兔分別于上述時(shí)間點(diǎn)行耳緣靜脈注射和肌肉注射生理鹽水。

1.4.2 給藥 對(duì)照組正常喂養(yǎng)；模型組給藥后正常喂養(yǎng)；治療組在注射LPS后即肌注TGF-β1，劑量為0.5 μg/kg,連續(xù)6 w。每組均予以肌注青霉素，劑量為20萬(wàn)單位/只，2次/周。

1.5 主要設(shè)備和儀器

1800全自動(dòng)生化分析儀：Siemens；光學(xué)顯微鏡：Olympus；電子計(jì)算機(jī)X射線斷層掃描機(jī)：GE Revolution。

1.6 血清脂質(zhì)生化檢查

分別在第3、7周末時(shí)間節(jié)點(diǎn)，各組均在兔右側(cè)耳緣靜脈采血，并使用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定各組動(dòng)物的總膽固醇(total cholesterol，TC)、三酰甘油(triglyceride，TG)的血清水平。

1.7 CT檢查

在第7周末，各組均用空氣栓塞法處死新西蘭大白兔，并取出雙側(cè)股骨頭。CT影像成像在淮南市第一人民醫(yī)院影像科完成，使用電子計(jì)算機(jī)X射線斷層掃描機(jī)進(jìn)行雙側(cè)股骨頭斷層掃描成像。

1.8 股骨頭形態(tài)學(xué)檢查

在第7周末，各組均用空氣栓塞法處死新西蘭大白兔，取出雙側(cè)股骨頭。放入10%福爾馬林溶液中固定脫鈣，浸蠟包埋，制成切片并行HE染色。光鏡下觀察各組骨小梁、骨細(xì)胞的變化，計(jì)數(shù)空骨陷窩并計(jì)算空骨陷窩率。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，各組間采用單因素方差分析，再進(jìn)行兩兩比較(LSD)，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 第3周末和第7周末時(shí)各組的血清脂質(zhì)檢測(cè)結(jié)果

各組間單因素方差分析顯著性水平均小于0.01。與對(duì)照組相比，其余兩組在第3周末時(shí)TC、TG均出現(xiàn)明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；第7周末時(shí)，與模型組相比，治療組的TC、TG降低，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 各組血脂指標(biāo)的比較

2.2 各組兔股骨頭HE染色觀察結(jié)果

7周末對(duì)照組：骨小梁結(jié)構(gòu)完整，排列整齊，空骨陷窩少見，未見大量脂肪細(xì)胞增生和嗜酸性粒細(xì)胞聚集，見圖1A；7周末模型組：骨小梁明顯變細(xì)且間有斷裂，走形差，空骨陷窩增多，部分陷窩內(nèi)骨細(xì)胞消失，可見脂肪堆積及大量的嗜酸性粒細(xì)胞聚集，見圖1B；7周末治療組：骨小梁變細(xì)且走形和結(jié)構(gòu)稍差，空骨陷窩較多，可見少量嗜酸性粒細(xì)胞和脂肪細(xì)胞增生，見圖1C。各組不同時(shí)間點(diǎn)空骨陷窩率的比較，見圖2。

圖1 第7周時(shí)各組股骨頭 HE 染色結(jié)果(× 100)

注：與對(duì)照組相比，aP<0.05；與對(duì)照組相比較，bP>0.05

2.3 CT檢查結(jié)果

7周對(duì)照組：檢查可見雙側(cè)股骨頭表面平滑，外形完整，股骨頭內(nèi)部未見明顯異常改變，見圖3A；7周模型組：檢查可雙側(cè)股骨頭表面不光滑，股骨頭塌陷，外形不規(guī)則，股骨頭內(nèi)部出現(xiàn)囊性改變并有低密度區(qū)域，見圖3B；7周治療組：可見雙側(cè)股骨頭表面稍不平滑，未見股骨頭塌陷，股骨頭內(nèi)部無(wú)明顯異常信號(hào)，見圖3C。

圖3 第7周時(shí)各組股骨頭CT結(jié)果

3 討 論

由于激素在臨床的廣泛的應(yīng)用，SANFH的發(fā)病率日益增加[12]，且該病好發(fā)于中青年(20～50歲)男性，這對(duì)個(gè)人和家庭的各個(gè)方面有著很大的不良影響。近年來(lái)，關(guān)于激素性股骨頭壞死機(jī)制的研究有很多，學(xué)者們也提出了多種假說(shuō)，這些假說(shuō)雖然可以從某個(gè)角度解釋激素性股骨頭壞死的病理機(jī)制，但又無(wú)法完全解釋激素性股骨頭壞死的病理演化過(guò)程。因而如何有效的預(yù)防和治療激素性股骨頭壞死仍是一個(gè)亟待解決的問(wèn)題。TGF-β1是龐大的TGF-β家族的一員，是骨細(xì)胞中最豐富的細(xì)胞因子[13]，在骨形成和骨修復(fù)中起著重要作用[14-17]。TGF-β1不僅能夠多個(gè)通路促進(jìn)前成骨細(xì)胞的分化和增殖，還可抑制成熟破骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞前體的增殖[18-19]。另外，TGF-β1對(duì)人成骨細(xì)胞具有顯著的趨化作這種效應(yīng)在低濃度的TGF-β1時(shí)特別明顯[20-21]。因而TGF-β1對(duì)股骨頭壞死的修復(fù)重建有著至關(guān)重要的作用。有研究表明SANFH患者體內(nèi)的TC、TG水平均顯著高于正常水平，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明，TC是導(dǎo)致股骨頭壞死的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[22-23]，這個(gè)發(fā)現(xiàn)與脂質(zhì)代謝紊亂學(xué)說(shuō)不謀而合。本實(shí)驗(yàn)中，模型復(fù)制后的模型組兔的TC、TG顯著高于對(duì)照組，且治療組TC和TG的水平顯著低于模型組。這說(shuō)明TGF-β1可以改善血脂升高的現(xiàn)象，其他學(xué)者的研究發(fā)現(xiàn)也證明了這一觀點(diǎn)[24-25]。這可能也是TGF-β1治療股骨頭壞死的途徑之一。此外，激素性股骨頭壞死部位的血運(yùn)情況差，往往會(huì)因局部缺血導(dǎo)致骨細(xì)胞凋亡。TGF-β1是促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和血管形成的活性因子之一，在機(jī)體損傷修復(fù)和血管重建的過(guò)程中扮演重要角色[26-27]。在本研究中治療組兔股骨頭HE染色的光鏡檢查結(jié)果優(yōu)于模型組也可能與此有關(guān)。

綜上所述，肌注TGF-β1治療激素性股骨頭壞死療效顯著，作用機(jī)制可能與促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化和增殖，抑制成熟破骨細(xì)胞增殖，降低血脂和重建血管改善股骨頭壞死部位的血液循環(huán)有關(guān)。