黃翠，劉祿社

(河南省人民醫(yī)院血液病研究所，河南 鄭州 450000)

白血病是一類常見的血液系統(tǒng)的非實(shí)體性惡性腫瘤，在14歲以下兒童中，其發(fā)病率與死亡率高居不下[1]。根據(jù)白血病分化程度、病程長(zhǎng)短可以分為急性、慢性白血病，發(fā)熱、貧血、出血傾向、骨和關(guān)節(jié)疼痛等為其常見癥狀，兒童及青少年多為急性白血病，起病急?。焕夏昙安糠智嗄耆硕酁槁园籽?，病情緩慢、逐漸進(jìn)展[2]。在過(guò)去的20年，對(duì)于白血病患兒臨床治療主要以藥物化療、骨髓移植治療、靶向治療為主，但由于細(xì)胞增殖后的失控、凋亡抑制及耐藥性的產(chǎn)生，導(dǎo)致部分患兒出現(xiàn)治療失敗或復(fù)發(fā)，因此，有效緩解疾病癥狀、降低復(fù)發(fā)率是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)工作者的主要目標(biāo)[3]。

白血病是造血干細(xì)胞的復(fù)制失去調(diào)控而引發(fā)的疾病[4]。當(dāng)機(jī)體遭受外界刺激或自身平衡機(jī)制發(fā)生紊亂時(shí)，體內(nèi)多種不同的生長(zhǎng)信號(hào)通路被激活。PI3K/Akt信號(hào)通路是體內(nèi)調(diào)節(jié)生長(zhǎng)、分化、凋亡的重要途徑，與細(xì)胞更替、血管新生等過(guò)程有關(guān)[5]。選擇PI3K/Akt信號(hào)通路中分子本身或過(guò)程中的相關(guān)分子進(jìn)行研究，是探討兒童白血病治療的醫(yī)學(xué)工作者們的研究熱點(diǎn)。

1 材料和方法

1.1 試劑與儀器

PI3K一抗兔抗(1∶1000)，來(lái)自Abcam公司(英國(guó))；兔來(lái)源的Akt一抗(1∶5000)，來(lái)自Abcam公司(英國(guó))；p53一抗兔抗(1∶5000)，來(lái)自Abcam公司(英國(guó))；caspase-3一抗兔抗(1∶1000)，來(lái)自Abcam公司(英國(guó))；兔抗來(lái)源β-actin抗體和HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG，購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；dNTP等，購(gòu)自美國(guó)Promega公司；電子天平，島津ATX124；低溫高速離心機(jī)，美國(guó)SCILOGEX公司；電泳儀，北京六一廠。

1.2 樣本來(lái)源

白血病患兒為醫(yī)院血液內(nèi)科2016年3月至2017年4月期間住院與門診的兒童，經(jīng)過(guò)MICM分型(即骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)、白血病免疫學(xué)分型、染色體及C-MYC融合基因)確定，符合FAB診斷系統(tǒng)分型標(biāo)準(zhǔn)，作為實(shí)驗(yàn)組。其中45例初治急性白血病患兒(A組)，男26例，女19例，中位年齡6歲；5例復(fù)發(fā)白血病患兒(B組)，男4例，女1例，中位年齡10歲；10例健康兒童作為正常對(duì)照組(C組)，男7例，女3例，中位年齡8歲。3組研究對(duì)象年齡、性別等構(gòu)成情況差異，均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。按照分組，納入對(duì)象均進(jìn)行骨髓穿刺，收集新鮮骨髓液，并從新鮮骨髓液中分離單個(gè)骨髓核細(xì)胞(-80 ℃保存)。所有樣本的收集均取得鄭州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)與兒童監(jiān)護(hù)人的知情同意。

1.3 方法

1.3.1 Western blot測(cè)定PI3K與Akt蛋白的表達(dá)

加入RIPA裂解液和蛋白酶抑制劑，4 ℃離心5 min，取上清，BCA法測(cè)定蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線后超低溫冰箱保存。取蛋白樣20 μg，加入足量的蛋白上樣緩沖液，100 ℃煮沸10 min，SDS-PAGE電泳后濕轉(zhuǎn)2 h，脫脂奶粉封閉結(jié)束后，分別加入兔來(lái)源的PI3K/Akt一抗過(guò)夜，TBST洗膜5分鐘/次，洗3次。二抗孵育(室溫1 h)，ECL顯影。β-actin作為內(nèi)參蛋白，采用Band Scan 5.0凝膠電泳圖像分析軟件對(duì)條帶進(jìn)行灰度分析。

1.3.2 用熒光定量PCR測(cè)定PI3K與Akt的mRNA表達(dá)

按照分組，分別提取骨髓核細(xì)胞中的總RNA，嚴(yán)格遵守RevertAid逆轉(zhuǎn)錄試劑盒中合成cDNA的方法。在冰浴條件下，往無(wú)菌離心管中依次加入5 μL dNTP、4 μL引物、2 μL Taq酶，加新鮮的ddH2O至50 μL。93 ℃預(yù)變性5 min，進(jìn)入循環(huán)階段：93 ℃變性40 s、58 ℃退火50 s，72 ℃延伸60 s，循環(huán)40次，最后在72 ℃保溫10 min后終止反應(yīng)。引物序列：

PI3K上游引物：5’-CCACCTCTTTGCCCTGAT-3’；下游引物：5’-TCGGTTCTTTCCCGTTAG-3’；

Akt上游引物：5’-ATGAGCGACGTGGCTATTGTGAAG-3’；下游引物：5’-GAGGCCGTCAGCCACAGTCTGGAT-3’;

β-actin上游引物：5’-TCATCACCATTGGCAATGAG-3’；下游引物：5’-CACTGTGTTGGCGTACAGGT-3’。

1.3.3 血清中乳酸脫氫酶的含量

抽取白血病患兒外周血4 mL，對(duì)照組健康兒童手臂空腹靜脈血4 mL，分別離心(3000轉(zhuǎn)，10 min)，取上清，放入生化分析儀中測(cè)定乳酸脫氫酶的含量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果

與對(duì)照組C組比較，初治急性白血病患兒(A組)與復(fù)發(fā)白血病患兒(B組)中PI3K、Akt、p53蛋白條帶逐漸變亮變寬，Caspase-3蛋白條帶逐漸變暗，數(shù)據(jù)結(jié)果分析顯示，與C組比較，A組、B組患兒的PI3K、Akt、p53蛋白表達(dá)水平均明顯升高，Caspase-3蛋白表達(dá)水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與B組比較，A組PI3K蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)、Akt蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)，而p53、Caspase-3蛋白表達(dá)水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖1、2，表1、2。

與對(duì)照組C比較，*P<0.05；與B組比較，#P<0.05

與對(duì)照組C比較，*P<0.05

表1 Western blot檢測(cè)中PI3K/Akt蛋白的

表2 Western blot 檢測(cè)中Caspase-3/p53蛋白的

2.2 RT-PCR檢測(cè)PI3K/Akt的mRNA實(shí)驗(yàn)結(jié)果

A組、B組患兒PI3K、Akt的mRNA含量范圍為2.56～3.78，C組兒童組PI3K/Akt的mRNA含量范圍為1.02～1.38相比，與C組比較，A組、B組患兒的PI3K mRNA水平、Akt mRNA水平均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與B組比較，A組患兒PI3K mRNA水平明顯降低、Akt mRNA水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖3、表3。

與對(duì)照組C比較，*P<0.05；與B組比較，#P<0.05

表3 RT-PCR測(cè)定PI3K/Akt的mRNA表達(dá)水平

2.3 血清中乳酸脫氫酶(LDH)的檢測(cè)結(jié)果

與C組比較，A組、B組患兒血清LDH含量均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；A組、B組患兒血清LDH水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表4。

表4 各組血清LDH含量比較

3 討 論

白血病是一種惡性克隆性血液障礙性系統(tǒng)疾病，白血病的形態(tài)學(xué)、免疫學(xué)、細(xì)胞免疫分型等在白血病的診斷過(guò)程中具有重要作用[6]。急性髓細(xì)胞白血病(AML)是我國(guó)幼兒白血病常見類型之一，其中急性單核細(xì)胞白血病患兒人數(shù)所占AML比例較大。化療是目前治療白血病的主要方式，雖然在臨床治療方面取得一定療效，但是仍有部分患兒從初治急性白血病轉(zhuǎn)為復(fù)雜難治性白血病，而復(fù)雜難治性白血病患兒的預(yù)后差、生存期短。因此，亟需研制新藥物用于治療白血病。

LDH是由糖酵后形成乳酸、被氧化成丙酮酸，在人體心臟、肺、骨骼肌、肝、腎、脾組織中廣泛存在[7]。研究表明，機(jī)體組織出現(xiàn)癌變?cè)斐杉?xì)胞生長(zhǎng)失調(diào)，過(guò)多的LDH向周圍組織轉(zhuǎn)運(yùn)、擴(kuò)散、進(jìn)入，刺激組織出現(xiàn)反應(yīng)性LDH大量釋放，從而反應(yīng)腫瘤細(xì)胞的增殖情況[8]。已有研究顯示LDH含量升高是初診急性白血病患者腫瘤溶解綜合征的發(fā)病危險(xiǎn)因素[9]，還有學(xué)者認(rèn)為初診時(shí)LDH水平異常升高是兒童伯基特白血病的預(yù)后不良因素[10]，本研究發(fā)現(xiàn)，初治急性白血病患兒與復(fù)發(fā)白血病患兒血清中LDH的含量明顯高于對(duì)照組中健康測(cè)試兒童的含量，由此推測(cè)LDH含量異常升高可能對(duì)白血病患兒疾病治療效果、預(yù)后評(píng)估有一定的參考價(jià)值。

PI3K/Akt是細(xì)胞生長(zhǎng)與分化的重要通路之一[11]。在細(xì)胞外活性因子的刺激下，磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)與相關(guān)受體結(jié)合，如胰島素樣生長(zhǎng)因子(insulin-like growth factor，IGF)、血小板源性生長(zhǎng)因子(platelet-derived growth factor，PDGF)、表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor，EGF)等，被激活，吸引產(chǎn)生3,4二磷酸磷脂酰肌醇和3,4,5三磷酸磷脂酰肌醇向細(xì)胞膜靠近，募集蛋白激酶B(serine/threonine kinase，AKT)，形成二聚體使AKT進(jìn)入活化狀態(tài)，激活的AKT從細(xì)胞膜上解離下來(lái)，釋放入細(xì)胞漿內(nèi)繼續(xù)傳遞生物學(xué)信號(hào)，啟動(dòng)細(xì)胞核內(nèi)生長(zhǎng)與分化信號(hào)[12-13]。Akt是一類絲氨酸/蘇氨酸的蛋白激酶，活化后可直接啟動(dòng)生長(zhǎng)基因的大量表達(dá)[14]。受到大家廣泛關(guān)注的p53，是一個(gè)重要的腫瘤抑制因子，50%以上的惡性腫瘤中被發(fā)現(xiàn)有該基因的突變。當(dāng)細(xì)胞受到外界刺激或自身功能出現(xiàn)障礙時(shí)，p53基因啟動(dòng)表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)，決定細(xì)胞進(jìn)入正常分裂還是走向凋亡[15]。有研究表明，正常情況下，p53為重要的腫瘤抑制基因，當(dāng)其發(fā)生突變后，分子構(gòu)象發(fā)生改變，從而失去對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)與凋亡的調(diào)控作用，突變?yōu)榘┗?，轉(zhuǎn)為主動(dòng)的致癌[16]。Caspase-3為一類蛋白酶，參與DNA修復(fù)、基因完整性監(jiān)護(hù)，為細(xì)胞凋亡過(guò)程中最主要的終末剪切酶，其作用不可替代；Caspase-3最主要的底物是多聚(ADP-核糖)聚合酶PARP〔poly(ADP-ribose) polymerase〕[17-18]。本研究發(fā)現(xiàn)，白血病患兒體內(nèi) PI3K/Akt含量較健康兒童顯著性偏高，p53含量明顯偏高，Caspase-3含量顯著減少。除調(diào)控PI3K/Akt信號(hào)通路來(lái)控制細(xì)胞的生長(zhǎng)，突變的p53大量表達(dá)促進(jìn)癌細(xì)胞生長(zhǎng)，Caspase-3無(wú)法及時(shí)清除大量的多聚聚合酶，無(wú)法滿足減緩細(xì)胞生長(zhǎng)的步伐，造成體內(nèi)造血干細(xì)胞大量復(fù)制。因而，控制p53/Caspase-3含量變化，可為調(diào)控PI3K/Akt信號(hào)通路提供另一種方法。

綜上所知，在白血病的分子治療過(guò)程中，將PI3K/Akt信號(hào)阻斷劑作為優(yōu)先考慮方向，通過(guò)下調(diào)PI3K/Akt蛋白的表達(dá)，起到減弱白血病患兒造血干細(xì)胞惡性復(fù)制的情況。