張 瑤 吳龍國 馬桂娟 龔 慧 高 琳 孫 謙

(1. 寧夏食品檢測研究院，寧夏 銀川 750021；2. 寧夏大學(xué)，寧夏 銀川 750021； 3. 島津企業(yè)管理〔中國〕有限公司，陜西 西安 710032)

蔬菜作為人們?nèi)粘ｏ嬍持胁豢苫蛉钡氖澄镏?，主要為機體提供所需的維生素、礦物質(zhì)、纖維等營養(yǎng)物質(zhì)，以滿足機體正常的新陳代謝。而在蔬菜種植過程中會發(fā)生各種各樣的病蟲害，種植者常常會使用農(nóng)藥殺菌劑進行防治，避免蔬菜進一步受到病蟲害的侵染，這就很容易造成殺菌劑在蔬菜中的殘留問題，對人體身體健康存在潛在的危害。

目前，中國蔬菜作物上登記的殺菌劑成分150種，不同成分登記的殺菌劑產(chǎn)品達220種[1]。最新發(fā)布的《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中農(nóng)藥最大殘留限量》，新增了51種農(nóng)藥、2 967項農(nóng)藥最大殘留量限量標(biāo)準(zhǔn)[2]。中國學(xué)者針對殺菌劑在水果[3-7]、蔬菜[8-13]以及土壤[14-15]中的殘留做了大量的研究，結(jié)果表明在農(nóng)產(chǎn)品中殺菌劑殘留檢出率較高，尤其番茄和黃瓜中常見的啶氧菌酯、E-苯氧菌酯、醚菌酯、嘧螨酯、肟菌酯、醚菌胺、肟醚菌酯、氟嘧菌酯、吡唑醚菌酯、嘧菌酯10種殺菌劑殘留尤為突出。

隨著現(xiàn)代分析化學(xué)技術(shù)的提高，農(nóng)藥殘留檢測也有了迅速的發(fā)展，農(nóng)藥殘留檢測主要采用氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[16-17]、液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法[18-20]等。液相色譜法和氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法容易受到基質(zhì)的干擾，耗時耗力、檢測效率低，不能滿足目前殺菌劑種類不斷增加、分析通量相應(yīng)提高的需求。由于固相萃取(Solid Phase Extraction，SPE)通過選擇性吸附、選擇性洗脫的方式對樣品進行富集、分離、純化，可同時完成樣品富集與凈化，大大提高了檢測靈敏度。因此，試驗擬采用氣相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法結(jié)合固相萃取技術(shù)對番茄和黃瓜中殺菌劑殘留的檢測進行研究，旨在為監(jiān)測其他蔬菜中的農(nóng)藥殘留提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

1.1.1 材料與試劑

啶氧菌酯、E-苯氧菌酯、醚菌酯、嘧螨酯、肟菌酯、醚菌胺、肟醚菌酯、氟嘧菌酯、吡唑醚菌酯、嘧菌酯標(biāo)準(zhǔn)品：純度>99%，德國Dr.Ehrenstorfer公司；

甲苯、丙酮、環(huán)己烷、正己烷、乙酸乙酯：色譜純，賽默飛世爾科技有限公司；

氯化鈉：優(yōu)級純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；

乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)：色譜純，美國安捷倫公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

三重四極桿氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀：GCMS-TQ 8040型，島津企業(yè)管理(中國)有限公司；

數(shù)顯型分散機：IKAT25型，德國IKA公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：BUCHI V-850型，瑞士步琦實驗室公司；

全自動凝膠凈化系統(tǒng)：GPC1000型，北京萊伯泰科儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 將啶氧菌酯、E-苯氧菌酯、醚菌酯、嘧螨酯、肟菌酯、醚菌胺、肟醚菌酯、氟嘧菌酯、吡唑醚菌酯、嘧菌酯的標(biāo)準(zhǔn)品用甲苯配制成1.0 mg/mL的殺菌劑標(biāo)準(zhǔn)溶液。再根據(jù)試驗所需配置成一定濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.2 樣品前處理 分別稱取15.00 g制備好的番茄和黃瓜蔬菜混勻的試樣于50 mL塑料離心管中，加入5 g氯化鈉，加入15 mL乙腈溶液，先10 000 r/min高速勻漿2 min，再以4 000 r/min離心6 min，轉(zhuǎn)移上清液于梨形瓶中，加入30 mL乙腈，重復(fù)提取1次，合并2次上清液，40 ℃濃縮至近干，用2 mL環(huán)己烷—乙酸乙酯溶解雞心瓶中殘留物。

1.2.3 SPE凈化 將1.2.2中溶解液過固相萃取柱，以乙酸乙酯/環(huán)己烷為洗脫液，收集洗脫液，40 ℃旋蒸，用2 mL 乙酸乙酯/環(huán)己烷定容，加入PSA，混勻，0.22 μm濾膜過濾，供GC-MS/MS測定。

1.2.4 GPC凈化 將1.2.2中溶解液置于GPC樣品瓶中，采用GPC進行凈化，環(huán)己烷乙酸乙酯作為流動相，設(shè)置參數(shù)：進樣體積2 mL，流速4 mL/min，在波長254 nm下進行檢測。在第11～19 min內(nèi)收集洗脫液至雞心瓶中，40 ℃旋蒸，用2 mL乙酸乙酯/環(huán)己烷定容，加入PSA，混勻，0.22 μm濾膜過濾，供GC-MS/MS測定。

1.3 儀器條件

色譜柱：HP-5MS (30 m×0.25 mm×0.25 μm)；柱溫程序：初設(shè)溫度160 ℃，保持1 min；以15 ℃/min升至280 ℃，保持2 min；再以10 ℃/min升溫至300 ℃，保持10 min。流速：1.4 mL/min；進樣量：1 μL；進樣方式：不分流進樣；載氣：氦氣，純度≥99.999%；進樣口溫度：300 ℃；流速控制方式：恒線速度方式；柱流量：1.2 mL/min；進樣方式：不分流進樣；高壓進樣：250 kPa(1 min)；離子化方式：EI；離子源溫度：230 ℃；色譜質(zhì)譜接口溫度：280 ℃；檢測器電壓：調(diào)諧電壓+0.6 kV；采集模式：MRM；啶氧菌酯、E-苯氧菌酯、醚菌酯、嘧螨酯、肟菌酯、醚菌胺、肟醚菌酯、氟嘧菌酯、吡唑醚菌酯、嘧菌酯的離子對及保留時間信息見表1。

1. 啶氧菌酯 2. E-苯氧菌酯 3. 醚菌酯 4. 嘧螨酯 5. 肟菌酯 6. 醚菌胺 7. 肟醚菌酯 8. 氟嘧菌酯 9. 吡唑醚菌酯 10. 嘧菌酯

表1 化合物名稱、保留時間及選擇離子

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

在SCAN掃描模式下，將10種殺菌劑(啶氧菌酯、E-苯氧菌酯、醚菌酯、嘧螨酯、肟菌酯、醚菌胺、肟醚菌酯、氟嘧菌酯、吡唑醚菌酯、嘧菌酯)目標(biāo)化合物進行全掃描，獲得各個物質(zhì)的保留時間以及質(zhì)荷比較大、豐度較高的特征性一級碎片離子。利用EI源采用不同能量值轟擊母離子，得到不同能量下的二級質(zhì)譜圖。選擇豐度較高、質(zhì)荷比較大、特征性強的離子以確定最優(yōu)的碰撞能量，在此能量值合適范圍內(nèi)做進一步優(yōu)化，獲取最佳碰撞能量，得到100 μg/L質(zhì)量濃度的10種殺菌劑標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖，如圖1所示。

2.2 前處理條件優(yōu)化

2.2.1 提取試劑的選擇 因啶氧菌酯、E-苯氧菌酯、醚菌酯、嘧螨酯、肟菌酯、醚菌胺、肟醚菌酯、氟嘧菌酯、吡唑醚菌酯、嘧菌酯10種殺菌劑屬于不同結(jié)構(gòu)的化合物，但易溶于甲苯、乙腈等有機試劑，而且以乙腈作為提取溶劑，可以減少雜質(zhì)干擾，同時沉淀蛋白質(zhì)，使提取率更高，提高待測組分的回收率。

相比采用乙酸乙酯/正己烷(1∶1)，正己烷/丙酮(4∶6)，采用乙腈作為提取試劑對 10種殺菌劑的回收率范圍較合適，主要是因為乙酸乙酯/正己烷(1∶1)與正己烷/丙酮(4∶6)作提取劑時，提取的色素等雜質(zhì)較多，不宜凈化，對待測目標(biāo)物的干擾較大。

2.2.2 提取方式的選擇 對比了勻漿、超聲、振蕩3種提取方式：均質(zhì)提取2 min、超聲提取20 min和震蕩提取30 min。經(jīng)試驗證明，超聲和振蕩對樣品的粉碎程度要求較高，且回收率偏低。勻漿提取，花費時間較短，樣品均勻分散，且經(jīng)過兩次反復(fù)提取，回收率較高。

2.2.3 凈化方式的選擇 對比分析了石墨氨基柱、GPC以及氨基柱的固相萃取凈化方式對除去色素干擾的效果。試驗結(jié)果表明：10種甲氧基丙烯酸酯類化合物經(jīng)石墨氨基柱凈化后，除氟嘧菌酯回收率低于30%，剩余物質(zhì)均介于83.6%～117.9%，主要是源于石墨化炭黑對平面結(jié)構(gòu)的農(nóng)藥有一定的吸附作用。氟嘧菌酯分子結(jié)構(gòu)中含氯苯氧基和苯基以及六元雜環(huán)，容易被吸附，因此，難以從石墨氨基凈化柱上洗脫。采用GPC凈化時，由于不同基質(zhì)對吸收波長下樣品接收存在不同程度的干擾，容易造成回收率偏高，且對試劑的消耗量較大，雖凈化效果較好，但不適合大批量、多種復(fù)雜基質(zhì)的檢測。而采用氨基柱，10種物質(zhì)在番茄中的回收率范圍均為84.7%～117.0%，回收范圍較好，且方便快捷，可應(yīng)用于不同基質(zhì)的大批量樣品的同時檢測分析。因此，最終選擇氨基柱進行凈化。

2.2.4 基質(zhì)效應(yīng) 由于基質(zhì)效應(yīng)的存在，容易得到假陽性或假陰性的錯誤檢測結(jié)果，并對待測樣的準(zhǔn)確定量造成嚴(yán)重干擾[15]。為了避免基質(zhì)效應(yīng)的影響，同時提高待測樣品的檢測準(zhǔn)確度，采用不含殺菌劑的提取液作為空白基質(zhì)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而降低基質(zhì)對測定結(jié)果的影響。為了對比不同殺菌劑的基質(zhì)效應(yīng)，按式(1)求得10種殺菌劑的基質(zhì)效應(yīng)。10種甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑在番茄和黃瓜中的基質(zhì)效應(yīng)如圖2所示。

圖2 10種殺菌劑在黃瓜和番茄中的基質(zhì)效應(yīng)

ME=Km/Ks，

(1)

式中：

ME——基質(zhì)效應(yīng)；

Km——基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率；

Ks——溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率。

2.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍及檢出限 為降低基質(zhì)中的干擾物質(zhì)對目標(biāo)化合物產(chǎn)生基質(zhì)效應(yīng)，分別提取了不含殺菌劑的番茄與黃瓜提取液作為空白基質(zhì)液。用空白基質(zhì)提取液將混合標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋成相應(yīng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后進行測定。10種殺菌劑的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍及檢出限(信噪比S/N≥3)見表2。結(jié)果表明，10種殺菌劑在基質(zhì)中相關(guān)系數(shù)均達到0.999 1以上。

表2 相關(guān)系數(shù)及靈敏度測試結(jié)果

2.3 回收率和重現(xiàn)性

通過回收試驗，測定方法的準(zhǔn)確度和精密度(n=6)，

添加回收率試驗結(jié)果見表3。取不含待測成分的空白樣品在0.05，0.01 mg/kg的濃度水平上進行加標(biāo)回收試驗，每個水平重復(fù)6次，按照試驗方法對樣品進行提取、凈化，測得番茄、黃瓜中的加標(biāo)回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)如表3所示。

表3 番茄和黃瓜中10種殺菌劑的平均回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差

2.4 實際樣品的檢測

隨機抽取檢測市場上購買的蔬菜樣品19份，其中嘧菌酯、吡唑醚菌酯、醚菌酯、肟菌酯、啶氧菌酯的檢出率分別是28.1%，15.6%，12.5%，6.2%，3.1%，其余均為未檢出。

3 結(jié)論

試驗采用氣相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜結(jié)合固相萃取技術(shù)，對蔬菜中啶氧菌酯、E-苯氧菌酯、醚菌酯、嘧螨酯、肟菌酯、醚菌胺、肟醚菌酯、氟嘧菌酯、吡唑醚菌酯、嘧菌酯10種殺菌劑殘留進行了測定。結(jié)果顯示，10種殺菌劑藥在1.0～200.0 μg/L的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均>0.999 1，方法檢出限為0.1～0.5 μg/kg。實際樣品加標(biāo)回收率為84.7%～117.0%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)為0.4%～4.7%。結(jié)果表明，采用高效氣相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法結(jié)合固相萃取技術(shù)的試驗方法凈化效果較好，穩(wěn)定準(zhǔn)確，靈敏度高。后續(xù)將擴大檢測樣品的類型和數(shù)量，不斷去驗證該方法的穩(wěn)定性。