班晶晶 劉貴珊 何建國(guó) 程麗娟 樊奈昀 袁瑞瑞

(寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏 銀川 750021)

恩諾沙星[1-乙基-6-氟-1,4-二氫-4-氧代-7-(1-哌嗪基)-1,8萘啶-3-喹啉羧酸，ENO]是一種廣譜抗生素類，其化學(xué)結(jié)構(gòu)中包含一個(gè)萘啶環(huán)代替喹啉環(huán)。由于具有良好的吸收和較低的不良反應(yīng)頻率[1]，恩諾沙星在家禽養(yǎng)殖業(yè)中被廣泛用于疾病的預(yù)防和治療，但同時(shí)也會(huì)造成獸藥殘留。許多國(guó)家規(guī)定恩諾沙星的殘留量標(biāo)準(zhǔn)為50～500 μg/kg，而中國(guó)規(guī)定的最高殘留量為100 μg/kg[2]。

目前，常見的藥物殘留量檢測(cè)方法有酶聯(lián)免疫檢測(cè)技術(shù)[3]、氣相-質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)[4]和液相-質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)[5]等。但這些方法的樣品處理繁瑣、時(shí)間長(zhǎng)、成本高，難以實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)快捷的準(zhǔn)確定量檢測(cè)。而表面增強(qiáng)拉曼光譜(SERS)技術(shù)具有敏銳、快速、高效的特征，可用于現(xiàn)場(chǎng)實(shí)時(shí)快速檢測(cè)。由于SERS的優(yōu)點(diǎn)，使其在科研工程中備受關(guān)注[6-8]。將二維相關(guān)光譜法(2D-COS)與SERS結(jié)合可應(yīng)用于乙酸乙酯中氯吡脲的檢測(cè)[9]、茶葉中殘留毒死蜱的拉曼特征波優(yōu)選[10]、大米中甲基毒死蜱等拉曼光譜的特征優(yōu)選[11]及中藥、油類的參假檢測(cè)[12-13]等。2D-COS 不僅增強(qiáng)了光譜分辨率，還可凸顯重疊峰與弱峰，反映外擾因素的變化。因此，通過設(shè)置特定的外擾因素構(gòu)建2D-COS，可確定與外擾因素最相關(guān)的特征峰[14]。

試驗(yàn)擬以雞肉為研究對(duì)象，以自制銀溶膠為活性基底，采用SERS技術(shù)與2D-COS技術(shù)相結(jié)合對(duì)恩諾沙星進(jìn)行檢測(cè)分析，為抗生素殘留的快速檢測(cè)提供新的方法措施，為拉曼光譜在畜禽肉類的質(zhì)量安全快速檢測(cè)方面提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

雞胸肉：市售；

恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)品：上海源野生物科技有限公司；

乙酸乙酯、硝酸銀：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

檸檬酸三鈉：分析純，汕頭西隴化工股份有限公司；

氯化鈉、無水硫酸鈉：分析純，天津市永大化學(xué)試劑有限公司；

試驗(yàn)用水為自制超純水。

1.1.2 儀器與設(shè)備

激光拉曼光譜儀：DXR型，美國(guó)ThermoFisher公司；

紫外分光光度計(jì)：UV1902PC型，上海棱光技術(shù)有限公司；

均質(zhì)機(jī)：FA40型，德國(guó)弗魯克公司；

天平：FB224型，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 銀溶膠的制備 參照文獻(xiàn)[15]的方法并修改。將150 mL 0.02%的AgNO3溶液加入至300 mL燒杯中，加熱至沸騰，緩慢加入4 mL 1%的檸檬酸三鈉至溶液顏色為灰綠色，再繼續(xù)加熱2 min，冷卻，備用。

1.2.2 雞肉提取液的制備

(1) 雞肉提取液的制備：參照文獻(xiàn)[16]的方法并修改。取200 g雞肉，搗碎成肉糜，于-18 ℃下密封保存。準(zhǔn)確稱取5 g雞肉糜和6.0 g無水硫酸鈉于50 mL離心管中，加入15 mL乙酸乙酯，均質(zhì)1 min，6 000 r/min離心10 min，過濾，濾渣重復(fù)提取一次，過濾，合并上清液，即雞肉提取液，0～4 ℃貯藏備用。

(2) 雞肉提取液加標(biāo)樣本的配制：稱取5 mg恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)品，用雞肉提取液溶于50 mL棕色容量瓶中，超聲溶解后定容，得100 mg/L的加標(biāo)雞肉提取液樣本。再用雞肉提取液將其稀釋成15個(gè)濃度梯度，分別用字母B～P表示(0.05，0.10，0.30，0.50，0.70，1.00，2.00，3.00，4.00，5.00，5.10，5.30，5.50，5.70，6.00 mg/L)雞肉提取液加標(biāo)樣本。

1.2.3 氯化鈉溶液的制備 稱取0.528 g氯化鈉溶于100 mL 超純水，得0.1 mol/L的氯化鈉溶液。

1.3 SERS光譜采集

將400 μL銀溶膠、20 μL待測(cè)液及100 μL氯化鈉溶液依次加入到2 mL按壓式帶塞離心管中，混勻后進(jìn)行SERS光譜采集。激光光源波長(zhǎng)780 nm，20倍物鏡，激光光源功率6 mW，狹縫寬度50 μm，光譜采集范圍400～2 800 cm-1。

1.4 二維相關(guān)分析

以恩諾沙星濃度為外擾變量進(jìn)行2D-COS分析，得到二維相關(guān)光譜的同步和異步相關(guān)譜圖。自相關(guān)峰表示化學(xué)基團(tuán)對(duì)恩諾沙星濃度微擾的敏感程度，以同步二維相關(guān)譜圖中的等高線反映其相關(guān)峰的強(qiáng)弱，峰強(qiáng)度越高，表明該譜峰對(duì)外擾濃度越敏感[17]。

1.5 光譜預(yù)處理

采用標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)化(SNV)對(duì)原始反射光譜進(jìn)行預(yù)處理，采用競(jìng)爭(zhēng)性正自適應(yīng)加權(quán)算法(CARS)對(duì)預(yù)處理后的光譜進(jìn)行調(diào)整提取并建立預(yù)處理后光譜的偏最小二乘(PLSR)模型。

1.6 數(shù)據(jù)處理

使用Unscrambler X 10.4軟件進(jìn)行預(yù)處理和建立模型；使用Matlab 2014a提取特征波長(zhǎng)；使用Origin 8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)繪圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 雞肉提取液加標(biāo)樣本的SERS及2D-COS分析

由圖1、2可知，恩諾沙星的拉曼峰為732，1 320，1 437，1 531，1 624 cm-1；732，921，1 080，1 320，1 437，1 531，1 624 cm-1處有較強(qiáng)的拉曼峰。隨著雞肉提取液加標(biāo)樣本濃度的變化，732，1 437 cm-1處峰值有明顯變化。732 cm-1處峰是由于亞甲基的搖擺，1 320 cm-1處峰是由于對(duì)稱的O—C—O拉伸振動(dòng)，1 437 cm-1處峰是由于苯環(huán)的振動(dòng)，1 531 cm-1處峰是由于苯環(huán)的伸縮，1 624 cm-1處峰是由于C—O伸縮振動(dòng)[18]。

圖1 恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)品的拉曼光譜

圖2 雞肉提取液加標(biāo)樣本的表面增強(qiáng)拉曼光譜圖

圖3 拉曼二維相關(guān)同步譜圖

圖4 拉曼二維相關(guān)異步譜圖

2.2 基于二維相關(guān)光譜優(yōu)選變量的PLSR模型建立

由表1可知，CARS方法的Rc、Rp分別為0.718 2，0.876 7；2D-COS方法的Rc、Rp分別為0.979 7，0.997 2。結(jié)果表明，利用2D-COS方法優(yōu)選出的5個(gè)恩諾沙星特征譜峰所建立的PLSR模型性能優(yōu)于CARS方法的，說明利用2D-COS方法優(yōu)選的特征波建立的模型可用于雞肉中恩諾沙星殘留的實(shí)際估測(cè)。

表1 基于特征波段的PLSR建模效果

3 結(jié)論

使用SERS技術(shù)結(jié)合2D-COS方法對(duì)雞肉中的恩諾沙星殘留進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，利用2D-COS方法篩選出的5個(gè)與恩諾沙星濃度變化相關(guān)的特征峰(732，1 320，1 437，1 531，1 624 cm-1)與分析光譜信息得到的吸收峰吻合。相比于CARS提取特征波方法，2D-COS方法更能使得大量而又復(fù)雜的光譜信息簡(jiǎn)單化且能優(yōu)選出與恩諾沙星密切相關(guān)的特征峰，使復(fù)雜的拉曼光譜分析更加簡(jiǎn)單、可靠。SERS與2D-COS結(jié)合能對(duì)恩諾沙星進(jìn)行有效的特征波長(zhǎng)優(yōu)選，可應(yīng)用于雞肉中抗生素的檢測(cè)。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)SERS信號(hào)受活性基底影響較大，自制膠體穩(wěn)定性還有待提高。后續(xù)可以考慮在養(yǎng)殖過程中對(duì)肉雞進(jìn)行注射或飼料添加等方法，實(shí)現(xiàn)抗生素的均勻添加，再對(duì)雞肉進(jìn)行檢測(cè)，使該檢測(cè)方法得到有效的推廣和普及。