靳俊峰，劉銀花，歐小波，阮 媛，王海青，陳燕玲，吳秀香，易 華

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)在適當(dāng)?shù)臈l件下可分化為骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等，參與組織的修復(fù)和再生[1-2]。但機(jī)體衰老、氧化應(yīng)激、雌激素缺乏可削弱BMSCs的定向分化能力，并促使其向脂肪細(xì)胞分化，體內(nèi)脂肪累積則會引發(fā)代謝綜合征[3-4]。近年來研究表明天然藥物小分子可抑制低濃度H2O2引起的BMSCs成脂分化[5-6]。從中醫(yī)角度講，BMSCs屬于“腎”，是補(bǔ)腎中藥作用的一個重要的靶細(xì)胞。桑葚是一味重要的補(bǔ)腎中藥[7]，但桑葚是否能抑制氧化損傷引起的BMSCs成脂分化并不清楚。該文研究了桑葚水提物對低濃度H2O2引起的BMSCs成脂分化的影響，將有助于從現(xiàn)代生物學(xué)角度闡釋桑葚的補(bǔ)腎功效。

1 材料與方法

1.1 實驗動物SPF級SD雄性大鼠，4周齡，體質(zhì)量60～80 g，購自廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心，動物許可證號：SCXK(粵)2013-0034，質(zhì)量合格證號：44005900002468。室溫飼養(yǎng)(22±1) ℃。所有動物實驗程序符合《廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物倫理委員會章程》。

1.2 試劑與藥物DMEM低糖培養(yǎng)基、胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、油紅O工作液(美國Abcam公司)；CCK-8試劑盒(LG689)(上海東仁化學(xué)科技有限公司)；抗 CD29-FITC、CD44-FITC、CD45-PE-Cy5.5和CD90-PE流式抗體(美國Abcam公司)；Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒(杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司)；桑葚(廣州杏園春藥房)；Triton X-100(廣州健陽生物科技有限公司)；抗-過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferatiors-activated receptors，PPARγ)(H-100)、抗-CCAAT/強(qiáng)子結(jié)合蛋白α(CCAAT enhancer binding proteins，C/EBPα)(D-5)(美國Santa Cruz公司)；Alexa Fluor 555標(biāo)記驢抗兔IgG、4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)。

1.3 主要儀器SHZ-D(III)循環(huán)水式真空泵(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE52C(上海亞榮生化儀器廠)；FD系列冷凍干燥機(jī)FD-1A-50(上海漢諾儀器有限公司)；PerkinElmer EnSpire多功能酶標(biāo)儀(上海珀金埃爾默管理有限公司)；流式細(xì)胞儀(BD Accuri C-5)。

1.4 檢測指標(biāo)與方法

1.4.1流式細(xì)胞術(shù)鑒定BMSCs 頸椎脫位法處死大鼠，分離股骨，暴露骨髓腔，DMEM低糖培養(yǎng)基吹打骨髓腔。1 000 r/min離心骨髓沖洗液8 min，棄上清液，重懸，接種培養(yǎng)瓶，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，傳代，P3代BMSCs用于后續(xù)實驗。常規(guī)消化、離心，調(diào)整細(xì)胞密度為1.0×106，分為空白對照組、同型對照組和實驗組。吸細(xì)胞懸液50 μl加CD29-FITC、CD44-FITC、CD45-PE-Cy5.5和CD90-PE等5 μl。避光孵育30 min，洗2遍。離心棄上清液，重懸，檢測。重復(fù)3次，F(xiàn)low Jo 7.6軟件分析數(shù)據(jù)。

1.4.2真空冷凍干燥法制備桑葚水提物 稱桑葚10.659 8 g，加200 ml雙蒸水，煮沸30 min。布氏漏斗減壓抽濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器將濾液分離。冷凍干燥機(jī)-53.4 ℃、-20 MPa抽真空，冷凍干燥，稱量。

1.4.3CCK-8檢測桑葚水提物對BMSCs生長的影響 P3代BMSCs以1×104/ml接種于96孔板，加100 μl BMSCs懸液，培養(yǎng)。24 h棄培養(yǎng)基，分組：正常對照組(DMEM低糖培養(yǎng)基培養(yǎng))、桑葚水提物(15、30、60 mg/L)，空白對照組調(diào)零，每組5個復(fù)孔。24 h棄培養(yǎng)基，加CCK-8工作液10 μl，培養(yǎng)1 h，檢測。

1.4.4油紅O染色檢測及半定量分析 P3代BMSCs以1×104/ml接種于有無菌圓載玻片的24孔板，培養(yǎng)。PBS配100 μmol/L的H2O2誘導(dǎo)液，作用1 h。分為H2O2模型組、桑葚水提物(15、30、60 mg/L)組，正常培養(yǎng)的BMSCs為對照組。4%多聚甲醛固定30 min；洗3次，每孔加入500 μl油紅O工作液，25 min后60 %異丙醇洗1次，雙蒸水洗3次；蘇木精染色15 s，水洗3次，封片。隨機(jī)選取5個高倍視野，計數(shù)陽性細(xì)胞，統(tǒng)計學(xué)處理。

1.4.5免疫熒光檢測PPARγ和C/EBPα的表達(dá) P3代BMSCs以1×104/ml接種100 μl于有無菌圓載玻片的24孔板，分為對照組、H2O2模型組、桑葚水提物(60 mg/L)組。細(xì)胞接近長滿4%多聚甲醛固定30 min。PBS洗3次。0.3% Triton X-100室溫30 min，洗3次，5% BSA封閉30 min，棄封閉液，加I抗PPARγ(1 ∶100)、C/EBPα(1 ∶100)，4 ℃孵育過夜，洗3次×5 min/次，加II抗Alexa Fluor 555標(biāo)記的驢抗兔IgG(1 ∶200)避光孵育30 min，洗3次，DAPI(1 ∶1 000)染3 min。洗3次，封片，PBS替代I抗作為陰性對照。

1.4.6Western blot檢測PPARγ和C/EBPα P3代BMSCs以1×104/ml接種1 ml于6孔板，分對照組、H2O2模型組、桑葚水提物(60 mg/L)組。細(xì)胞接近長滿后預(yù)冷PBS洗2遍，加入裂解液(RIPA ∶PMSF=100 ∶1)，收集細(xì)胞，冰上裂解30 min，超聲5 min，12 000 r/min離心10 min，取上清液，CA蛋白定量將樣品濃度調(diào)整一致后煮沸。蛋白30～50 μg電泳；轉(zhuǎn)PVDF膜，封閉2.5 h，I抗4 ℃過夜；TBST洗6次，II抗孵育1 h；TBST洗6次，曝光，Image J軟件分析，統(tǒng)計學(xué)處理。

2 結(jié)果

2.1 BMSCs形態(tài)學(xué)觀察及鑒定原代細(xì)胞24 h貼壁，圖1A顯示，P1代呈長梭形，早期混雜有雜細(xì)胞，換液、傳代去除，圖1B顯示P3代已較純。流式細(xì)胞術(shù)圖1C顯示，高表達(dá)CD44(99.20%)、CD29(99.02%)和CD90(99.94%)，低表達(dá)CD45(6.41%)。

2.2 桑葚水提物對正常BMSCs生長的影響稱量桑葚10.659 8 g，真空、低溫、冷凍、干燥得桑葚水提物6.262 6 g，提取率58.75%。高、中、低劑量(15、30、60 mg/L)作用于BMSCs，24 h酶標(biāo)儀檢測，統(tǒng)計學(xué)處理，表1顯示，15、30、60 mg/L桑葚水提物對BMSCs的生長與正常對照組BMSCs生長相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表1 桑葚水提物對大鼠BMSCs生長的影響

2.3 桑葚水提物對H2O2刺激后BMSCs成脂分化的影響油紅O染色將脂肪染成深紅色。圖2顯示，對照組染色陰性；模型組較多深紅色陽性產(chǎn)物；15 mg/L桑葚水提物組脂滴生成無影響；30 mg/L桑葚水提物組脂滴減少；60 mg/L桑葚水提物組抑制脂滴生成。

計數(shù)各組陽性細(xì)胞數(shù)，圖3統(tǒng)計學(xué)分析顯示：模型組與正常對照組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，模型組與15 mg/L組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，這兩組與30、60 mg/L兩組相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；30 mg/L組與60 mg/L組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，60 mg/L桑葚水提物對成脂分化抑制作用最大，后續(xù)實驗均采用此濃度。

圖1 大鼠BMSCs的培養(yǎng)和鑒定 ×200

2.4 桑葚水提物對H2O2刺激后BMSCs胞質(zhì)內(nèi)PPARγ和C/EBPα表達(dá)的影響圖4顯示，PPARγ和C/EBPα陽性產(chǎn)物呈紅色，對照組PPARγ和C/EBPα無表達(dá)，模型組表達(dá)，60 mg/L桑葚水提物組表達(dá)減少。圖5顯示，Western blot結(jié)果與上述結(jié)果具有一致性，模型組與60 mg/L桑葚水提物組相比，PPARγ和C/EBPα表達(dá)差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

圖2 桑葚水提物抑制H2O2刺激后BMSCs成脂分化油紅O染色×400

圖3 桑葚水提物減少H2O2刺激后BMSCs成脂分化細(xì)胞數(shù)

3 討論

真空冷凍干燥是利用升華的原理使物質(zhì)脫水的一種干燥技術(shù)，該方法所得的活性成分含量與新鮮樣品最接近[8]。本研究將桑葚水提物進(jìn)行真空冷凍干燥，最大程度的保留了桑葚的有效成分，提取率較高。本課題組前期使用高效液相色譜分析表明，桑葚水提物中含有5種黃酮類化合物(桑色素、蘆丁、紫云英苷、異槲皮素、木犀草素)和2種非黃酮類化合物(綠原酸、桑橙素)，這7個化合物分子骨架不盡相同，但都含有酚羥基，其中，蘆丁、紫云英苷、異槲皮素、木犀草素、綠原酸、桑橙素含有強(qiáng)抗氧化活性的鄰二酚羥基結(jié)構(gòu)，而鄰二酚羥基被認(rèn)為是細(xì)胞保護(hù)作用的重要來源[9]，本結(jié)果說明上述桑葚水提物中的主要有效成分協(xié)同發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，實現(xiàn)對·OH損傷的間充質(zhì)干細(xì)胞保護(hù)作用，這與本課題組前期的研究[10]結(jié)果是一致的。

圖4 免疫熒光檢測各組PPARγ和C/EBPα的表達(dá) ×400

圖5 Western blot法檢測各組PPARγ和C/EBPα的表達(dá)水平

氧化應(yīng)激可使細(xì)胞產(chǎn)生大量的自由基，過量自由基會導(dǎo)致細(xì)胞衰老、癌變或功能異常。本實驗中使用的細(xì)胞是全骨髓法獲取的BMSCs，P3代細(xì)胞經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測顯示，已經(jīng)較為純化，可用于后續(xù)實驗，與文獻(xiàn)[11]報道相一致。本項目組前期發(fā)現(xiàn)100 μmol/L H2O2氧化損傷BMSCs后對細(xì)胞生長無抑制，但可促進(jìn)細(xì)胞成脂分化[12]，本實驗繼續(xù)采用這種低濃度H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞模型進(jìn)行實驗。油紅 O具有很強(qiáng)的染脂質(zhì)作用，可以將細(xì)胞或組織內(nèi)的脂質(zhì)染成紅色。本實驗結(jié)果顯示，隨著桑葚水提物濃度的增加，其對H2O2誘導(dǎo)后的BMSCs脂滴生成抑制作用增強(qiáng)，具有量效關(guān)系，可見，桑葚水提物對氧化損傷的BMSCs有保護(hù)作用，有助于維持BMSCs的干細(xì)胞狀態(tài)。

PPARγ和C/EBPα是細(xì)胞成脂分化的兩個關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，目前的研究[13-14]顯示，PPARγ和C/EBPα可通過協(xié)同作用來影響3T3-L1 前脂肪細(xì)胞向脂肪細(xì)胞的分化，有報道[6-7]顯示，芥子堿、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、穿心蓮內(nèi)酯等中藥有效成分可通過抑制PPARγ和C/EBPα的表達(dá)抑制H2O2誘導(dǎo)后BMSCs中脂滴形成。本研究結(jié)果顯示，正常BMSCs中PPARγ和C/EBPα無表達(dá)，H2O2刺激后BMSCs中PPARγ和C/EBPα的表達(dá)均增加，60 mg/L桑葚水提物則可抑制模型細(xì)胞中PPARγ和C/EBPα的表達(dá)，與文獻(xiàn)報道具有一致性，提示桑葚水提物可通過抑制PPARγ和C/EBPα的協(xié)同表達(dá)抑制H2O2誘導(dǎo)后BMSCs成脂分化。

綜上所述，桑葚水提物對正常的BMSCs生長并無影響，對H2O2損傷的BMSCs有保護(hù)作用，可通過抑制PPARγ和C/EBPα的表達(dá)而減少H2O2誘導(dǎo)后BMSCs內(nèi)脂滴的生成，有助于維持BMSCs的干細(xì)胞特性，本研究結(jié)果從現(xiàn)代生物學(xué)的角度闡釋了補(bǔ)腎中藥桑葚對其靶細(xì)胞BMSCs的調(diào)控。