董小婉， 陳婷婷，吳 翌，金秀蘭，汪靚婧，周換麗，王佑民

碘攝入量的多少與甲狀腺疾病的呈U關(guān)系，U字型的底端是最適宜人類(lèi)的最佳碘劑量，無(wú)論碘的攝入量是過(guò)低還是過(guò)高，都會(huì)增加甲狀腺疾病的患病風(fēng)險(xiǎn)。由碘攝入量不足引起的碘缺乏病，通過(guò)推行全民食鹽碘化已得到極大改善，但同時(shí)人群中碘營(yíng)養(yǎng)水平處于碘超足量和過(guò)量的個(gè)體數(shù)量在增多。近年來(lái)甲狀腺疾病的發(fā)病率不斷上升，臨床專(zhuān)家和公衛(wèi)專(zhuān)家意見(jiàn)不一致，臨床認(rèn)為甲狀腺疾病的增多與碘鹽有很大關(guān)系，攝入過(guò)多的碘致使甲狀腺疾病增多,但是目前有關(guān)其作用機(jī)制的研究還比較缺乏[1]。鈉/碘共同轉(zhuǎn)運(yùn)體(Na+/I-symporter，NIS)是一種跨膜糖蛋白,主要表達(dá)于甲狀腺濾泡細(xì)胞基底膜上,是甲狀腺細(xì)胞攝取碘的分子基礎(chǔ)。如果NIS蛋白的表達(dá)缺失或功能異常，就會(huì)造成甲狀腺攝取、聚集和利用碘功能的異常[2]。故該研究構(gòu)建不同碘營(yíng)養(yǎng)水平的大鼠動(dòng)物模型，分析不同碘營(yíng)養(yǎng)水平對(duì)大鼠甲狀腺NIS基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化的影響，探討碘是否通過(guò)該途徑影響NIS的表達(dá)而參與甲狀腺疾病發(fā)生。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源選用35～42 d, 體質(zhì)量150～170 g的SPF級(jí)雌性SD大鼠40只，購(gòu)自安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：NO.340000200001326, 按隨機(jī)數(shù)字表法分為5組：低碘組(LI組)、適碘組(NI組)、5倍高碘組(5HI組)、10倍高碘組(10HI組)、20倍高碘組(20HI組)。大鼠飼養(yǎng)條件：溫度(22±2) ℃，濕度45%～70%，晝夜交替各12 h。均給予低碘飼料(平均碘含量小于50 μg/kg)；LI組飲用去離子水(碘含量為0 μg/L), NI組、5HI組、10HI組及20HI組均飲用加碘化鉀的去離子水。按大鼠每日進(jìn)食20 g, 進(jìn)水20 ml估計(jì)每只大鼠每日的總攝碘量為:LI組<1.00 μg;NI組6.15 μg;5HI組30.75 μg；10HI組61.50 μg；20HI組123.00 μg。飼養(yǎng)3個(gè)月后處死。

1.2 方法

1.2.1標(biāo)本制備 使用代謝籠收集每只大鼠24 h尿標(biāo)本, 水合氯醛0.3 ml/100 g體質(zhì)量，腹腔注射麻醉，下腔靜脈取血，2 000 r/min離心10 min，分離血清于-80 ℃保存待測(cè)游離三碘甲狀原氨酸 (free triiodothyronine，F(xiàn)T3)、 游離甲狀腺素(free thyroxine，F(xiàn)T4)、促甲狀腺激素(thyroid stimulating hormone，TSH)；剝離甲狀腺,稱(chēng)重后于液氮保存。

1.2.2尿碘和激素測(cè)定 尿碘采用電感耦合等離子體質(zhì)譜法(inductively coupled plasma mass spectrometry，ICP-MS)測(cè)定，尿碘與給碘劑量呈正相關(guān)提示造模成功。血清 FT3、FT4、TSH由安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌實(shí)驗(yàn)室釆用化學(xué)發(fā)光技術(shù)的競(jìng)爭(zhēng)免疫法(美國(guó)西門(mén)子公司試劑盒)測(cè)定，應(yīng)用德國(guó)西門(mén)子醫(yī)學(xué)診斷有限公司化學(xué)免疫分析儀(型號(hào): ADVIA centaur XP)。

1.2.3免疫組化檢測(cè)NIS蛋白表達(dá) 每組隨機(jī)選取2只大鼠甲狀腺石蠟切片脫蠟水化，檸檬酸緩沖液微波抗原修復(fù)，3% H2O2室溫孵育10 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗，滴加大鼠NIS抗體，工作濃度為1 ∶400，4 ℃冰箱過(guò)夜，滴加二抗聚合物，37 ℃孵育30 min，緩沖液清洗，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，脫水，透明，樹(shù)脂封片，陰性對(duì)照用緩沖液替代一抗。 400倍光鏡下每張切片隨機(jī)取5個(gè)視野,使用Image Pro Plus圖像分析軟件分析累積光密度值。

1.2.4硫化測(cè)序PCR(bisulfite sequencing PCR,BSP)法檢測(cè)甲基化 每組隨機(jī)選取3只大鼠，使用天根生化科技(北京)有限公司的組織DNA提取試劑盒, 按照說(shuō)明書(shū)的步驟提取甲狀腺組織DNA。按DNA亞硫酸氫鹽修飾試劑盒(德國(guó)QIAGEN公司)使用說(shuō)明書(shū)操作進(jìn)行DNA的亞硫酸氫鈉修飾及純化回收。通過(guò)NCBI查找大鼠NIS基因(Gene ID:114613)啟動(dòng)子區(qū)域，選擇轉(zhuǎn)錄起始前2 000 bp至第一個(gè)外顯子作為分析區(qū)域。采用生物信息學(xué)在線(xiàn)網(wǎng)站MethPrimer對(duì)基因啟動(dòng)子區(qū)域CpG島進(jìn)行分析，經(jīng)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)NIS基因啟動(dòng)子區(qū)域具有2個(gè)CpG島，長(zhǎng)度分別為137 bp和556 bp。因?yàn)?個(gè)甲基化區(qū)域挨的很近且較大，因此劃分為兩個(gè)反應(yīng)進(jìn)行的。根據(jù) NIS 基因序列設(shè)計(jì)NIS基因CpG島引物如下：① F：5′-AGTTGYGGAGAAAGGTAGATGTTTTTTGG G-3′，R：5′-CTACAAATTTATTAAACTCCAAAATCAA CRC-3′；② F：5′-TTTATYGAGTTATTTGTTTTTATGG AGGGTG-3′，R：5′-CRACAAAAAAAAAAACRCTAT AAACAACRA-3′。擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度分別為363 bp和342 bp，引物由華大基因科技有限公司合成 。擴(kuò)增條件為:95 ℃預(yù)變性10 min。40個(gè)熱循環(huán) (94 ℃ 30 s、退火30 s、72 ℃ 40 s), 72 ℃延伸5 min。將目標(biāo)片段割膠純化。PCR 產(chǎn)物純化后連接克隆載體，采用Generay 的PGH(Lot：GV0108)作為載體，XL10-Gold感受態(tài)進(jìn)行轉(zhuǎn)化、復(fù)蘇和涂板。挑取質(zhì)粒送北京六合華大基因科技有限公司測(cè)序，使用BiQ Analyzer v2.0對(duì)測(cè)序的結(jié)果進(jìn)行對(duì)比和甲基化分析。

2 結(jié)果

2.1 各組血清甲狀腺激素水平與適碘組比較，低碘組和各高碘組血清FT3 濃度均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；但低碘組與各高碘組比較，血清FT3水平無(wú)明顯差異。與適碘組比較，低碘組和各高碘組血清FT4略增高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；大鼠血清 TSH 各組間比較，低碘組、適碘組、各高碘組的血清TSH水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 大鼠血清甲狀腺激素水平的檢測(cè)結(jié)果

2.2 各組NIS蛋白表達(dá)水平與NI組比較，LI組大鼠甲狀腺組織中NIS表達(dá)水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而10HI組及20HI組大鼠甲狀腺組織中NIS表達(dá)水平低于NI組(P<0.01)，5HI組與NI組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖1、2。

圖1 大鼠甲狀腺中NIS表達(dá)水平 DAB染色×400

圖2 各組大鼠甲狀腺組織中NIS蛋白表達(dá)量

2.3 各組NIS基因CpG島甲基化比較經(jīng)分析顯示NIS基因啟動(dòng)子區(qū)域有2個(gè)CpG島(Island 1,CpG1；Island 2,CpG2)，見(jiàn)圖3。每個(gè)CpG島平均甲基化率=[CpG島甲基化的CpG個(gè)數(shù)(m)/該CpG島總 CpG 個(gè)數(shù)(M)]×100%。比較各組CpG1甲基化比率及CpG2甲基化比率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；本文還研究了NIS啟動(dòng)子區(qū)域-420至-110堿基序列(CpG3)，與適碘組比較，低碘組和各高碘組CpG3甲基化比率降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組NIS基因CpG島甲基化情況(n=3)

3 討論

甲狀腺是人體最大的內(nèi)分泌腺，功能是合成甲狀腺激素，對(duì)幾乎所有組織的代謝調(diào)節(jié)都至關(guān)重要。碘嚴(yán)重缺乏致使甲狀腺功能減退，影響兒童神經(jīng)及智力發(fā)育，同時(shí)誘發(fā)甲狀腺功能亢進(jìn)癥。而碘過(guò)量攝入也可引起各種疾病，如甲狀腺自身免疫病，甚至甲狀腺癌等。補(bǔ)碘政策實(shí)施后，我國(guó)碘缺乏病發(fā)生率大大降低，但西部偏遠(yuǎn)地區(qū)仍存在嚴(yán)重碘缺乏情況。另外，高碘攝入、區(qū)域過(guò)量碘攝入引發(fā)的各種疾病，成為我們必須高度關(guān)注的問(wèn)題[3]?？傊M(jìn)一步明確碘攝入量對(duì)甲狀腺疾病的影響，了解其作用機(jī)制才能控制甲狀腺疾病的發(fā)生，保證居民的身體健康。本研究用不同濃度碘飼養(yǎng)大鼠，3個(gè)月后檢測(cè)尿碘提示尿碘與給碘劑量呈正相關(guān)，說(shuō)明本研究大鼠造模成功[4]。低碘組和各高碘組與適碘組相比，血清FT3差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明碘對(duì)大鼠血清甲狀腺激素水平有影響；與李思果 等[5]研究結(jié)論一致。

人NIS(hNIS)又稱(chēng)SLC5A5(solute carrier family 5 member 5)，基因位于19號(hào)染色體(19p13.11)上，高度專(zhuān)一且有效地編碼80～90 ku跨膜糖蛋白，介導(dǎo)碘從血流到甲狀腺濾泡細(xì)胞的主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)。此運(yùn)輸通過(guò)Na+/K+-ATPase泵產(chǎn)生的能量梯度完成，這是甲狀腺激素生物合成關(guān)鍵的第一步[2]。編碼hNIS的cDNA與鼠NIS(rNIS)相似。使用 rNIS cDNA序列的引物通過(guò)PCR從人甲狀腺乳頭狀癌組織中擴(kuò)增出hNIS的cDNA片段，該cDNA片段用于篩選人類(lèi)甲狀腺cDNA文庫(kù)，編碼hNIS的單個(gè)cDNA克隆被分離。hNIS基因有含1929個(gè)核苷酸的開(kāi)放閱讀框，它編碼643個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。hNIS基因編碼84%的氨基酸和rNIS有93%的相似性，僅因rNIS蛋白水平中不存在的兩次插入而有所不同：5個(gè)氨基酸插入在最后兩個(gè)疏水域之間(氨基酸485-488和499)和20個(gè)氨基酸插入在羧基末端(氨基酸618-637)[6]。

圖3 NIS基因啟動(dòng)子區(qū)域CpG島分析結(jié)果

葉艷 等[7]利用組織芯片分析NIS在不同碘攝入量下的大鼠組織器官的分布及表達(dá)，研究發(fā)現(xiàn),與適碘組比較, NIS在低碘組甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞基底膜呈線(xiàn)性分布強(qiáng)表達(dá), 而在高碘組較弱表達(dá)；本研究利用免疫組化檢測(cè)大鼠甲狀腺NIS蛋白的表達(dá)也得出了上述結(jié)論，進(jìn)一步證實(shí)了碘影響大鼠甲狀腺組織中NIS蛋白表達(dá)，但具體的、精確的機(jī)制尚需進(jìn)一步探討。近年研究發(fā)現(xiàn),表觀遺傳學(xué)會(huì)是疾病發(fā)生的重要機(jī)制，主要有以下調(diào)控方式:DNA甲基化、組蛋白修飾、非編碼RNA等機(jī)制。許敬 等[8]應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)(real-time methylation-specific PCR，qMSP)分別檢測(cè)152例甲狀腺乳頭狀癌組織及癌旁正常組織中NIS基因啟動(dòng)子區(qū)5′-CpG島的甲基化情況，研究表明，與癌旁正常組織相比，甲狀腺乳頭狀癌組織中NIS基因啟動(dòng)子區(qū)5′-CpG島的甲基化率顯著升高，致使甲狀腺惡性腫瘤中NIS基因表達(dá)降低；這與Galr?o et al[9]研究是一致的。本文通過(guò)前瞻性的研究，分析碘攝入量對(duì)大鼠甲狀腺NIS基因啟動(dòng)子區(qū)5′-CpG島甲基化是否有影響。對(duì)通過(guò)MethPrimer網(wǎng)站預(yù)測(cè)的基因啟動(dòng)子區(qū)域兩個(gè)CpG島進(jìn)行分析，研究顯示各組大鼠對(duì)應(yīng)的兩個(gè)CpG島均未見(jiàn)明顯差異。Serrano-Nascimento et al[10]報(bào)道調(diào)控大鼠NIS基因表達(dá)的區(qū)域主要包含位于近端啟動(dòng)子相對(duì)于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)-110～-420的核苷酸，以及影響TSH的增強(qiáng)劑(NUE)，在-2 264和-2 495核苷酸之間；故本研究進(jìn)一步分析-110～-420的核苷酸序列(CpG3)CG位點(diǎn)甲基化情況，發(fā)現(xiàn)各組之間仍無(wú)顯著性差異。Lakshmanan et al[11]研究顯示在甲狀腺惡性腫瘤中microRNA(miR)可以調(diào)節(jié)NIS蛋白的表達(dá)，miR-339-5p過(guò)表達(dá)降低了表達(dá)外源性hNIS HEK293細(xì)胞中NIS介導(dǎo)的放射性碘攝入(RAIU)。Li et al[12]及Tang et al[13]研究分別發(fā)現(xiàn)miR-146b和miR-875-5p也可以調(diào)節(jié)NIS的表達(dá)。Puppin et al[14]研究表示組蛋白脫乙酰基酶(HDAC)抑制劑可激活甲狀腺腫瘤細(xì)胞中的NIS表達(dá)。這提示碘可能通過(guò)組蛋白修飾、miR等其他機(jī)制調(diào)節(jié)甲狀腺組織中NIS表達(dá)。

本研究利用BSP法檢測(cè)不同碘攝入量大鼠甲狀腺NIS基因啟動(dòng)子區(qū)5′-CpG 島甲基化情況，結(jié)果顯示在各組大鼠中DNA甲基化無(wú)明顯差異，但不同碘營(yíng)養(yǎng)組NIS表達(dá)存在差異，提示碘可能通過(guò)其他機(jī)制調(diào)節(jié)NIS的蛋白表達(dá)。