梁瑞鵬，程 倩，陸春花，李 可，于恒恒，徐 彬，袁順杰，劉維薇，林 清

乳腺癌是女性最常診斷的惡性腫瘤之一，近年來無論是發(fā)病率還是致死率均高居首位[1]。眾所周知，乳腺癌是一組高度異質(zhì)性疾病，雌激素受體(estrogen receptor；ER)陽性乳腺癌約占所有乳腺癌70%，在乳腺癌患者占有較大比例。A型激酶錨定蛋白12(A kinase-anchored protein 12；AKAP12)是胞內(nèi)大分子支架蛋白與維持正常組織結(jié)構(gòu)功能完整[2]及腫瘤細胞增殖、侵襲轉(zhuǎn)移[3]等過程密切相關(guān)。AKAP12最早被用來評價重癥肌無力預(yù)后的抗原，隨后研究[4]發(fā)現(xiàn)在src基因、ras基因等原癌基因轉(zhuǎn)化的成纖維細胞中AKAP12表達明顯下調(diào)，文獻[5]報道，與正常組織相比，AKAP12在多種腫瘤中表達下調(diào)，如實體腫瘤肺癌、結(jié)直腸癌[3]、肝癌[6]，血液腫瘤如幼年髓單核細胞白血病[7]，在腫瘤細胞重新表達AKAP12抑制腫瘤細胞增殖、遷移侵襲，而干擾AKAP12則增加腫瘤細胞增殖、遷移侵襲能力，因此AKAP12被認為是潛在的抑癌基因。但AKAP12與乳腺癌生物學(xué)功能是否有關(guān)尚未闡明，AKAP12是否參與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展有待于研究。該研究通過干擾ER陽性乳腺癌MCF-7細胞中AKAP12表達來觀察其對ER陽性MCF-7細胞增殖、周期機制的影響，初步探討AKAP12在ER陽性乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 材料與方法

1.1 主要材料人乳腺癌細胞系MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-468和SK-BR-3以及乳腺正常上皮細胞MCF-10A均購自中國科學(xué)院上海細胞庫；特異性干擾AKAP12基因的慢病毒和陰性對照慢病毒購自吉凱公司；DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司；胎牛血清購自hyclone公司；CCK-8試劑購自上海諾維贊生物科技公司；RIPA裂解液(強)、蛋白酶抑制劑PMSF購自江蘇碧云天生物技術(shù)研究所；鼠抗人AKAP12單克隆抗體購自abcam公司；β-actin鼠抗人單克隆抗體購自proteintech公司；兔抗人P21抗體、兔抗人P27抗體以及鼠抗人CyclinD1抗體均購自proteintech公司。

1.2 細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染所有細胞用含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)于37 ℃、5% CO2的飽和濕度細胞培養(yǎng)箱；接種細胞于六孔板待貼壁穩(wěn)定，更換1 ml不含雙抗的DMEM完全培養(yǎng)基和40 μl病毒感染增強液(購自上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司)，按照1 ∶10的MOI值加入病毒液，24 h后更換正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，48 h后熒光顯微鏡下看細胞轉(zhuǎn)染效率(成功轉(zhuǎn)染細胞標記綠色熒光)，更換含有5 μg/ml嘌呤霉素的完全培養(yǎng)基進行藥物篩選。

1.3 Western blot檢測蛋白量收集細胞添加適量細胞裂解液(按照1 ∶100加入蛋白酶抑制劑)，冰上裂解10 min，4 ℃ 12 000 r/min離心10 min，收集上清液使用BCA法測定總蛋白濃度，按照20 μg上樣檢測，80 V恒壓電泳，電泳結(jié)束后采用 200 mA 恒流低溫轉(zhuǎn)膜至NC膜(AKAP12轉(zhuǎn)膜時間為2 h)，室溫5%脫脂奶粉封閉1.5 h，一抗4 ℃孵育12 h，PBST溶液清洗3次，每次5 min，二抗室溫孵育1 h，PBST溶液清洗3次，每次5 min。掃膜讀取條帶并測量條帶灰度值。

1.4 CCK-8細胞增殖實驗取各組處于對數(shù)生長期細胞消化計數(shù)，按照4 000個細胞/孔的密度鋪設(shè)于96孔板中，分別在24、48、72 h檢測結(jié)果。添加CCK8試劑后2 h后于酶標儀450 nm波長處讀值。

1.5 細胞平板克隆形成實驗取各組處于對數(shù)生長期細胞消化計數(shù)，按照2 000個每孔鋪設(shè)于6孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)兩周后，70%酒精固定，0.1%結(jié)晶紫染色晾干鏡下計數(shù)，大于50個細胞計數(shù)一個克隆。

1.6 生信網(wǎng)站分析乳腺癌中AKAP12表達與生存曲線使用乳腺癌數(shù)據(jù)網(wǎng)站Miner v4.1(bcGenExMiner v4.1)評估不同分子亞型乳腺癌中AKAP12表達情況和生存曲線分析。

2 結(jié)果

2.1 不同分子亞型乳腺癌AKAP12表達情況及乳腺癌Luminal A型高表達AKAP12生存愈后較好使用乳腺癌信息網(wǎng)站(http://bcgenex.centregauducheau.fr/BC-GEM/GEM-Accueil.php?js=1)分析AKAP12表達量與乳腺癌分子分型、預(yù)后相關(guān)信息[8]，結(jié)果顯示如圖1，各分子亞型乳腺癌AKAP12 mRNA水平明顯均低于正常組織(P<0.000 1)，且AKAP12在各個乳腺癌亞型的相對表達情況在不同分子分型存在差異；生存曲線顯示，Luminal A型乳腺癌患者較高的AKAP12代表較好的生存愈后(P<0.05)。

圖1 不同分子分型乳腺癌AKAP12表達情況及乳腺癌 Luminal A型高表達AKAP12生存愈后較好

2.2 AKAP12蛋白在各個分子分型乳腺癌細胞以及正常乳腺上皮細胞MCF-10A的表達水平選取實驗室常用各個分子分型乳腺癌細胞株以及人正常乳腺上皮細胞MCF-10A，檢測其AKAP12表達情況，結(jié)果顯示(圖2)，與正常乳腺上皮細胞株MCF-10A比較，各分子亞型乳腺癌細胞株明顯低表達AKAP12，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001，F(xiàn)值分別是19.00、16.01、13.61和21.89)，提示AKAP12的丟失或與乳腺癌發(fā)生相關(guān)。

圖2 AKAP12在各個分子亞型乳腺癌細胞以及正常乳腺上皮細胞MCF-10A的表達水平

2.3 慢病毒轉(zhuǎn)染MCF-7細胞及Western blot檢測AKAP12蛋白表達細胞經(jīng)慢病毒轉(zhuǎn)染后，Western blot檢測AKAP12蛋白水平的變化，檢測結(jié)果顯示(圖3)，與空載體對照組比較，shRNA-AKAP12細胞AKAP12蛋白表達下調(diào)，兩組細胞AKAP12蛋白表達差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.000 1，F(xiàn)=1.857)，表明細胞轉(zhuǎn)染成功，可進行后續(xù)實驗研究。

2.4 AKAP12對MCF-7細胞增殖能力的影響采用CCK-8增殖檢測和細胞克隆形成實驗評價AKAP12對MCF-7增殖能力的影響，72 h內(nèi)CCK-8檢測實驗結(jié)果顯示(圖4A)，與對照組相比，shRNA-AKAP12細胞表現(xiàn)出增殖速率加快，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.000 1，F(xiàn)=1.778)；細胞克隆形成是檢驗單個細胞長成一個獨立集落的能力，反映細胞增殖活力和持續(xù)增殖的能力，克隆形成結(jié)果顯示(圖4B、4C)，MCF-7細胞干擾AKAP12表達后表現(xiàn)為細胞克隆形成多于相應(yīng)空載體組，且克隆形成體積明顯大于空載體組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001，F(xiàn)=2.011)。綜上，干擾AKAP12表達促進MCF-7細胞的增殖能力，AKAP12或是其潛在的抑癌基因。

圖3 干擾AKAP12基因后MCF-7細胞AKAP12蛋白的表達水平

圖4 干擾AKAP12增強MCF-7細胞增殖能力

2.5 干擾AKAP12表達促進MCF-7細胞G1/S期進展干擾MCF-7細胞AKAP12表達后，Western blot檢測調(diào)控G1/S期轉(zhuǎn)換相關(guān)蛋白表達變化，檢測結(jié)果顯示抑制G1/S期轉(zhuǎn)換的P27、P21蛋白表達下調(diào)，尤其是P21蛋白，然而促進G1/S期進展的CyclinD1蛋白則表達上調(diào)。干擾AKAP12表達后增加MCF-7細胞的增殖能力，加快腫瘤細胞周期(G1/S期)進展是其機制之一。見圖5。

圖5 干擾AKAP12表達促進MCF-7細胞G1/S期進展

3 討論

腫瘤細胞持續(xù)增殖和凋亡受阻是其惡性行為及難于治療的原因之一。AKAP12與腫瘤細胞增殖關(guān)系密切：過表達miR-103通過抑制AKAP12表達增加PKC活性進而增加端粒酶活性促進肝癌細胞增殖[6]，抑制miR-103通過增加AKAP12表達進而可阻止端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶的核轉(zhuǎn)位和磷酸化，降低肝細胞肝癌HCC細胞中的端粒酶活性從而抑制增殖并促進HCC細胞的凋亡，非小細胞肺癌中TFAP2C通過誘導(dǎo)致癌miR-103的過表達阻斷AKAP12介導(dǎo)的細胞周期蛋白D1抑制進而促進肺癌細胞增殖[5]，纖維肉瘤HT1080細胞[9]研究中AKAP12誘導(dǎo)細胞凋亡與Bcl-2的表達降低和Bax的表達增加有關(guān)，并且降低Cyclin D1表達水平且阻滯其核定位，引起細胞周期阻滯。Liu et al[10]在結(jié)直腸癌Lovo細胞重表達AKAP12發(fā)現(xiàn)明顯抑制細胞生長并顯著增加cleaved-capase3水平誘導(dǎo)細胞凋亡。

綜上所述，AKAP12抑制腫瘤細胞增殖或通過控制細胞周期進展和促進凋亡相關(guān)蛋白表達。但也有研究通過臨床結(jié)直腸癌病例樣本免疫組化染色并沒有發(fā)現(xiàn)AKAP12與Bcl-2及P53存在統(tǒng)計學(xué)差異[11]，以及三陰性乳腺癌細胞Hs578T細胞中敲除AKAP12誘導(dǎo)細胞遷移能力增加[12]，但不影響細胞增殖凋亡。最初在大鼠MAT-LyLu(MLL)前列腺癌細胞中證實了AKAP12具有轉(zhuǎn)移抑制潛能， AKAP12重表達對原發(fā)部位腫瘤的生長影響甚微，但是明顯減少了肉眼可見肺部轉(zhuǎn)移，提示AKAP12發(fā)揮抑癌基因作用抑制腫瘤細胞增殖和遷移侵襲。但在黑色素瘤的研究中[13]，相較于正常皮膚，原發(fā)灶及轉(zhuǎn)移樣本均具有較高水平AKAP12 變體2表達，降低AKAP12 v2通過減少蛋白激酶A(PKA)調(diào)節(jié)的磷酸化減少黑色素瘤的遷移和侵襲，研究結(jié)果支持AKAP12 v2及其支架功能的存在對于體外轉(zhuǎn)移性黑色素瘤細胞遷移和侵襲是必要的，且較高表達AKAP12與不良生存相關(guān)，在對胃癌研究中[14]，基于GEO數(shù)據(jù)庫分析AKAP12在胃癌組織中的表達及臨床意義，研究認為高表達AKAP12預(yù)示著不良的愈后，這也提示AKAP12作為胞內(nèi)大分子支架蛋白通過錨定不同信號分子在腫瘤中存在復(fù)雜機制有待研究。

AKAP12在乳腺癌的研究鮮有報道。本研究顯示AKAP12在腫瘤細胞中表達下調(diào)，提示正常乳腺組織中丟失AKAP12或與乳腺癌發(fā)生有關(guān)；ER陽性MCF-7細胞相對于其他分子分型細胞株高表達AKAP12，這與Soh et al[12]研究存在差異，Soh et al[12]認為三陰性乳腺癌細胞AKAP12表達高于其他分子亞型。研究通過在MCF-7細胞干擾AKAP12基因后觀察細胞增殖、遷移侵襲等表型變化，實驗結(jié)果顯示AKAP12與MCF-7細胞增殖關(guān)系密切，干擾AKAP12則增強MCF-7細胞增殖能力，同時，研究也進行了Transwell實驗檢驗MCF-7親本株細胞及干擾AKAP12后細胞侵襲能力的變化，但未見到細胞穿過基底膜(數(shù)據(jù)未列出)。綜上，本研究表明干擾AKAP12增強乳腺癌MCF-7細胞的增殖能力，與AKAP12調(diào)控細胞周期G1-S期轉(zhuǎn)換相關(guān)。