虞 樂，黃春霞，胡 軍，周大臣，張 野

肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是最常見的惡性腫瘤之一，其轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)是造成肝癌患者死亡的主要原因。因此，探究肝癌轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)機制具有重要的臨床意義[1-2]，大量研究[3]顯示圍手術(shù)期的治療與處理對癌癥遠(yuǎn)期結(jié)局具有重要的影響。

右美托咪定(dexmedetomidine，DEX)是一類高選擇性α2腎上腺素受體激動劑，作為一種理想的鎮(zhèn)靜藥物被廣泛應(yīng)用于臨床實踐中[4]。有報道[5]認(rèn)為DEX可以有效地減輕圍術(shù)期刺激所造成的應(yīng)激與炎癥反應(yīng)，而最新的研究[6]提示DEX可促進(jìn)腺癌細(xì)胞在肺臟、肝臟，腎臟等多個器官生長與轉(zhuǎn)移，關(guān)于DEX對肝癌細(xì)胞的研究鮮有報道。該研究旨在探討右美托咪定對人肝癌細(xì)胞Huh-7增殖和遷移的影響，并探究其可能的分子機制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株人肝癌Huh-7細(xì)胞株由安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院肝膽胰外科饋贈。

1.2 實驗動物6只♂BALB/c裸鼠，4～6周齡，體質(zhì)量為(20±2)g，購于江蘇集萃藥康生物科技有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCKK(蘇)2018-0008。

1.3 試劑和儀器DMEM高糖培養(yǎng)基由Hyclone公司提供(貨號：SH30022.01)；南美胎牛血清購自美國Gibco公司(貨號：10437-028)；MTT(貨號：ST316)、RIPA細(xì)胞裂解液(貨號：P0013B)、和結(jié)晶紫水溶液(貨號：C0121)均購自北京碧云天生物技術(shù)公司；β-actin(貨號：3700)和沉默信息調(diào)節(jié)因子1(SIRT1)(貨號：8469)購于美國CST公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(貨號：ZB-2301)和辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(貨號：ZB-2305)購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；右美托咪定購自江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司(貨號：180425BP)。生物安全柜(型號：NU-425-400S)、二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱(型號：NU-5810E)購于美國NUAIRE公司；熒光倒置顯微鏡(型號：DeltaVision)購于美國GE公司。

1.4 方法

1.4.1細(xì)胞培養(yǎng) 將人肝癌細(xì)胞Huh-7細(xì)胞培育于含10%南美胎牛血清的高糖培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱。待密度為80%左右時，經(jīng)0.25%的胰蛋白酶消化，重懸，吹打成單細(xì)胞懸液，以1 ∶3傳代培養(yǎng)。

1.4.2細(xì)胞實驗分組與處理 將處于對數(shù)生長期Huh-7細(xì)胞常規(guī)接種于96孔板(3.5×104個/孔,100 μl/孔)或6孔板(3×105個/孔，2 ml/孔)，采取隨機數(shù)表法將細(xì)胞分為6組(n=5)：對照組(CON組)、0.1 nmol/L右美托咪定組(D1組)、1 nmol/L右美托咪定組(D2組)、10 nmol/L右美托咪定組(D3組)、氧糖剝奪/復(fù)氧復(fù)糖組(OGD/R組)、右美托咪定+氧糖剝奪/復(fù)氧復(fù)糖組(D+OGD/R組)。CON組正常培養(yǎng)；D1、D2、D3組分別加入終濃度為0.1、1、10 nmol/L的右美托咪定；OGD/R組和D+OGD/R 組氧糖剝奪6 h，復(fù)氧復(fù)糖24 h制備氧糖剝奪/復(fù)氧復(fù)糖損傷模型；D+OGD/R組于復(fù)氧復(fù)糖前加入終濃度0.1 nmol/L的右美托咪定處理24 h。

1.4.3構(gòu)建氧糖剝奪—復(fù)氧復(fù)糖損傷模型 當(dāng)細(xì)胞貼壁后，將OGD/R組和D+OGD/R組完全培養(yǎng)液更換為無糖無血清培養(yǎng)基，于37 ℃、5%CO2及95%N2的密閉小室中缺氧培養(yǎng)6 h，之后換成完全培養(yǎng)基，復(fù)氧復(fù)糖培養(yǎng)24 h，制備氧糖剝奪/復(fù)氧復(fù)糖損傷模型。

1.4.4細(xì)胞活力的測定 將Huh-7細(xì)胞接種于96孔板內(nèi)，處理結(jié)束后每組取3孔，加入5 g/L MTT溶液10 μl 37 ℃孵育4 h后加入150 μl二甲基亞砜室溫震蕩10 min，采用Synergy HT型多功能酶標(biāo)儀于波長570 nm和630 nm處測定OD值，用570 nm處OD值減去630 nm處OD值反映細(xì)胞活力。

1.4.5Western blot法檢測SIRT1的表達(dá) CON組和D1組(根據(jù)MTT實驗結(jié)果選擇)，PBS洗3遍，加入RIPA裂解液裂解細(xì)胞提取蛋白質(zhì)后，用BCA法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量，加上樣緩沖液煮沸10 min變性，以蛋白質(zhì)60 μg進(jìn)行SDS-PAGE電泳。轉(zhuǎn)膜后，用含5%～8%脫脂奶粉的TBST室溫慢搖封閉3 h，分別加入β-actin或SIRT1抗體。4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次，對應(yīng)加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔抗體(稀釋濃度1 ∶10 000)和羊抗鼠抗體(稀釋濃度1 ∶10 000)，室溫慢搖孵育1 h。洗膜后用ECL化學(xué)發(fā)光法檢測蛋白表達(dá)量，以SIRT1條帶灰度值與內(nèi)參β-actin條帶灰度值的比值反映SIRT1的表達(dá)水平。

1.4.6Transwell 實驗檢測細(xì)胞遷移能力 DMEM培養(yǎng)基饑餓Huh-7細(xì)胞24 h后，重懸細(xì)胞懸液至濃度為2×107個/L。下室中加入含30%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基600 μl，上室中加入經(jīng)過不同藥物處理的細(xì)胞懸液150 μl，放人孵箱中孵育24 h，每組設(shè)2個復(fù)孔。PBS洗滌后，4%多聚甲醛固定60 min，風(fēng)干加入0.1%結(jié)晶紫染色25 min，PBS洗滌3次。用棉簽擦凈上室里存留的液體，在倒置顯微鏡下拍照且計數(shù)，隨機選擇4個不同的視野進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

1.4.7 動物分組及處理SPF級BALB/c-nu雄鼠6只，4～6周齡，飼養(yǎng)于恒溫恒濕、置于12 h/12 h晝夜交替的環(huán)境中，自由攝取水和食物。采用隨機數(shù)表法分裸鼠為2組(n=3):對照組(CON組)和右美托咪定組(DEX組)。將Huh-7細(xì)胞(5×109個/L)皮下種植于裸鼠右側(cè)腋窩下。待瘤體達(dá)50 mm3時，DEX組裸鼠連續(xù)6 d注射右美托咪定(0.5 mg/kg)[6]，CON組連續(xù)6 d注射相應(yīng)體積生理鹽水，每次注射前記錄裸鼠的體質(zhì)量和瘤體的大小。接種腫瘤細(xì)胞30 d后處死裸鼠，取出瘤體記錄相應(yīng)的體積。

2 結(jié)果

2.1 右美托咪定對肝癌細(xì)胞活力的影響MTT比色法檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，加藥處理24 h后，D1、D2和D3組的細(xì)胞活性上升(P<0.05)，且當(dāng)右美托咪定濃度為0.1 nmol/L時，人肝癌Huh-7的細(xì)胞活性最強(P<0.01)。因此選擇0.1 nmol/L為本實驗的最適濃度。見表1。

表1 右美托咪定對Huh-7細(xì)胞活力的影響

2.2 右美托咪定對肝癌遷移能力的影響如圖1所示，0.1 nmol/L右美托咪定作用于人肝癌Huh-7細(xì)胞24 h后，穿膜的細(xì)胞數(shù)多于對照組。結(jié)果表明，右美托咪定增強了人肝癌Huh-7細(xì)胞的體外遷移能力，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

2.3 右美托咪定后處理對肝癌細(xì)胞缺氧缺糖/復(fù)氧損傷的影響如表2所示，與對照組相比，OGD/R組的細(xì)胞活力下降(P<0.05)。與OGD/R組相比，0.1 nmol/L的右美托咪定處理24 h可以減輕缺氧缺糖后復(fù)氧復(fù)糖造成的細(xì)胞損傷，提高人肝癌細(xì)胞Huh-7的細(xì)胞活力(P<0.05)。

2.4 右美托咪定后處理對缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖損傷后肝癌細(xì)胞遷移能力的影響如圖1所示，與對照組相比，右美托咪定組穿膜的細(xì)胞數(shù)增多，而OGD/R組穿膜的細(xì)胞數(shù)相對減少。與OGD/R組相比，D+OGD/R組穿膜的細(xì)胞數(shù)增加。結(jié)果表明，右美托咪定后處理可增強缺氧缺糖/復(fù)氧損傷后人肝癌細(xì)胞的遷移能力(P<0.05)。

圖1 右美托咪定對Huh-7細(xì)胞遷移能力的影響

表2 右美托咪定對OGD/R損傷后Huh-7細(xì)胞活力的影響

2.5 右美托咪定對Huh-7細(xì)胞SIRT1表達(dá)的影響Western blot 結(jié)果顯示，與CON組比較，D1組SIRT1的蛋白表達(dá)量增加，而OGD/R損傷后SIRT1表達(dá)下降。加入0.1 nmol/L右美托咪定后處理24 h可以減弱OGD/R損傷造成的SIRT1的表達(dá)減低。提示右美托咪定可以上調(diào)SIRT1表達(dá)(P<0.05)，右美托咪定促進(jìn)人肝癌Huh-7細(xì)胞株增殖與遷移可能與SIRT1上調(diào)有關(guān)。見圖2。

圖2 右美托咪定對Huh-7細(xì)胞SIRT1表達(dá)的影響

2.6 右美托咪定對裸鼠腫瘤體積的影響如圖3所示，DEX組裸鼠的體質(zhì)量和腫瘤瘤體的大小較CON組無明顯差異。

3 討論

肝癌是世界第三大惡性腫瘤，近年來在世界范圍內(nèi)的發(fā)病率急劇增加。我國作為肝炎大國，每年新發(fā)肝癌患者占全球新發(fā)總數(shù)的50%，發(fā)病率位列世界第一[7]。盡管肝癌診療水平不斷提高，手術(shù)切除仍是最主要治療手段。外科干預(yù)可以通過多種途徑影響腫瘤的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，而腫瘤的復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移已經(jīng)成為影響肝癌患者術(shù)后遠(yuǎn)期預(yù)后的關(guān)鍵性因素。研究表明圍術(shù)期麻醉藥物，可以直接影響癌細(xì)胞增殖和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫，從而間接干擾腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移[8]。

圖3 右美托咪定對裸鼠瘤體大小的影響

右美托咪定作為一種常用的麻醉藥物，研究顯示其對腫瘤患者有雙重作用。一方面，它可以治療腫瘤引起的持續(xù)性疼痛、躁動和譫妄，為腫瘤患者提供新的治療方案[9]。另一方面，有研究[10]指出右美托咪定可以通過改變上皮黏附因子表達(dá)，增加毛細(xì)血管通透性來影響腫瘤的擴散和轉(zhuǎn)移。探尋右美托咪定對肝癌細(xì)胞的生物學(xué)行為的影響具有重要意義。在本研究中采用MTT法檢測右美托咪定對人肝癌Huh-7細(xì)胞的影響，結(jié)果表明0.1 nmol/L的右美托咪定處理24 h對人肝癌Huh-7的促增殖效果最明顯。并在體外缺氧缺糖模型中證實0.1 nmol/L右美托咪定后處理24 h，可以逆轉(zhuǎn)缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖造成的人肝癌細(xì)胞損傷。運用Transwell法檢測右美托咪定對人肝癌細(xì)胞Huh-7遷移能力的影響，證實右美托咪定可以增強人肝癌Huh-7的遷移能力。Wang et al[11]研究提示右美托咪定增強腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移能力，可能是通過增加Ki67蛋白和細(xì)胞周期蛋白D的表達(dá)來完成。而陳泳花 等[12]研究表明右美托咪定通過下調(diào)HIF-1α的蛋白表達(dá)來抑制由缺氧誘導(dǎo)的肝癌MHCC97H和SMCC7721細(xì)胞的增殖以及血管生成。這種差異可能是因為缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞線粒體損傷程度的不同所造成。

本研究裸鼠實驗顯示右美托咪定并不能增加裸鼠腫瘤的體積。Wang et al[11]的研究同樣證實右美托咪定不能增加A549細(xì)胞構(gòu)建腫瘤大小。這可能是由于在體模型復(fù)雜的病理生理狀態(tài)影響了右美托咪定的藥理作用。同時觀察時間較短(30 d)與樣本量較小(n=3)也造成了實驗一定的局限性。

SIRT1是Sir2的哺乳動物同源體，是高度保守的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸依賴的組蛋白去乙?；?。SIRT1可以調(diào)控細(xì)胞增殖、應(yīng)激反應(yīng)、維持基因穩(wěn)定性和腫瘤的發(fā)生發(fā)展。但是SIRT1在腫瘤中的作用仍存在很大爭議[13]。有臨床研究[14]證實SIRT1高表達(dá)的患者，其腫瘤體積更大并且遠(yuǎn)期生存率更低。本實驗采用Western blot法證實，右美托咪定促進(jìn)人肝癌細(xì)胞Huh-7增殖和遷移的同時上調(diào)了SIRT1的表達(dá)。

綜上，右美托咪定可以增強人肝癌Huh-7細(xì)胞增殖和遷移的能力，其分子機制可能與上調(diào)SIRT1表達(dá)有關(guān)。在后期研究中將進(jìn)一步完善右美托咪定作用于人肝癌細(xì)胞的分子機制，為提高患者遠(yuǎn)期生存率提供新的思路。