劉小艷,黃 浩,魯梅芳,李 洪,呂正梅,蔡春林

融合蛋白是由聯(lián)合基因產(chǎn)生的連讀轉(zhuǎn)錄蛋白[1]。目前，僅有34個融合蛋白被描述[2]。近年來，已在不同的癌癥中檢測到了此類融合蛋白，并被推測可能具有致病性[3]。熱休克蛋白家族成員1(heat shock protein family member 1, HSPE1)是熱休克蛋白家族的一員，可以與線粒體熱休克蛋白60(heat shock proteinfamily D member1，HSPD1)“共伴侶”幫助其他蛋白質(zhì)折疊并驅(qū)動有缺陷的蛋白質(zhì)降解[4]。鼠類人α-趨化因子類似物(murine human-like alpha-chemokine analog one binder family member 4，MOB4)為MOB家族成員，可以結(jié)合蛋白激酶，在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮輔助信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用[5]。HSPE1-MOB4融合蛋白是由相鄰基因HSPE1和MOB4連讀形成，在正常組織中廣泛表達。目前，NCBI數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/553164)收錄的融合蛋白HSPE1-MOB4的信息中僅見分子量大小(約30 ku)及所對應(yīng)的一條mRNA序列。雖有報道在甲狀腺濾泡癌的蛋白組學(xué)分析及精神病基因組學(xué)聯(lián)盟的基因集中提及此融合蛋白[6-7]，但均未展開對此融合蛋白的研究。由此該研究對HSPE1-MOB4的表達及其融合亞型進行初步探索。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞系 本實驗所用細(xì)胞系：人正常胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1、人正常肝細(xì)胞LO-2、人正常卵巢上皮細(xì)胞IOSE-80、人正常肺上皮細(xì)胞HFL-1(CBP60185)、人胃癌細(xì)胞MGC803、人肝癌細(xì)胞Hep3B(CBP60197、人卵巢癌上皮細(xì)胞OV90、人肺癌上皮細(xì)胞A549(CBP60084)均購自南京科佰生物科技有限公司。

1.1.2試劑 DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清(以色列BI公司)；青霉素/鏈霉素(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；細(xì)胞總RNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本TaKaRa公司)；PCR Master mix(南京諾唯贊生物科技有限公司)；DNA瓊脂糖(西班牙BIOWESTE公司)；DNA Marker(廣東東盛生物科技有限公司)；DNA回收試劑盒(安徽朵能生物科技有限公司)；HSPE1、MOB4、HSPE1-MOB4鼠抗人多克隆抗體(武漢三鷹生物科技有限公司)；山羊抗鼠IgG(美國Proteintech公司)；顯影液(美國MILLIPORE公司)；PCDNA3.1(+)載體(北京質(zhì)粒載體菌種細(xì)胞基因保藏中心)；限制性核酸內(nèi)切酶EcoRI、XhoI(上海碧云天生物科技有限公司)；質(zhì)粒抽提試劑盒(上海碧云天生物科技有限公司)；磷酸鈣細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑盒(安徽朵能生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞總RNA的提取及處理 使用Primer 3.0軟件設(shè)計引物，并送生物公司合成。細(xì)胞總RNA的提取及逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)嚴(yán)格按照商品說明書實驗步驟操作。PCR擴增，總體系20 μl，以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板。程序為：95 ℃預(yù)熱5 min，94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個循環(huán)，最后一次延伸72 ℃10 min。融合蛋白HSPE1-MOB4所用引物為H1-M2。 具體引物名稱及序列見表1。

表1 PCR引物

1.2.2DNA瓊脂糖凝膠電泳及凝膠回收 2%的瓊脂糖凝膠，PCR產(chǎn)物全部上樣，電壓90 V。切條帶回收，按照試劑盒說明書操作，回收后送測序。

1.2.3質(zhì)粒載體的構(gòu)建 用EcoRI、XhoI消化載體及PCR回收產(chǎn)物，消化后的載體和片段回收，用回收后的載體和片段配連接體系，連接體系22 ℃ 2 h或16 ℃過夜連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化，涂氨芐抗性細(xì)菌板。篩選正確細(xì)菌克隆，抽提質(zhì)粒。鋪細(xì)胞爬片，轉(zhuǎn)染細(xì)胞，48 h后待用。

1.2.4細(xì)胞免疫熒光實驗 細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，棄培養(yǎng)基，4%多聚甲醛室溫固定30 min，搖床上PBS洗3遍，每次15 min，DAPI用PBS和TritonX-100所配制的破膜液1 ∶3 000稀釋，37 ℃避光靜置40 min，PBS避光洗3次，每次15 min，將洗好的爬片放置于載玻片上，加入抗熒光猝滅劑，避光放置，待干燥后加固定液將爬片固定于載玻片上，4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5蛋白質(zhì)免疫印跡實驗 培養(yǎng)細(xì)胞至滿皿，收集細(xì)胞，提取總蛋白，煮樣；15%的聚丙烯酰胺凝膠，電壓90 V，進行SDS-PAGE蛋白凝膠電泳，轉(zhuǎn)印至醋酸纖維素膜，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，HSPE1、MOB4、HSPE1-MOB4鼠抗人多克隆抗體用TBST配置的1%牛奶1 ∶2 000稀釋，4 ℃過夜孵育，TBST洗膜3次，每次20 min。二抗用含TBST的2.5 %牛奶1 ∶5 000稀釋，室溫孵育2 h，洗膜3次，每次20 min。顯影，拍照。

2 結(jié)果

2.1 融合蛋白HSPE1-MOB4有兩種融合形式瓊脂糖凝膠電泳顯示有2條帶，分別切膠回收送測序。融合蛋白HSPE1-MOB4的大小約為30 ku，對應(yīng)的編碼區(qū)序列長度約為783 bp，測序結(jié)果顯示有兩種序列。融合部位的兩端堿基相同，融合處堿基不同且數(shù)量也存在差異，一種堿基數(shù)為61 bp，另一種堿基數(shù)為88 bp，說明這是兩種不同的融合形式。融合部位堿基數(shù)為61 bp所在的序列為Pubmed上已公示的序列，且Pubmed上僅顯示了這一條序列。已公示的融合部位為HSPE1的第三個外顯子和MOB4的第一個外顯子，實驗中另一種融合部位為HSPE1的第一個外顯子和MOB4的第二個外顯子，是一種尚未被報道的融合形式。圖1～6中已被報道的HSPE1和MOB4信息均來源于NCBI數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ gene/)。

圖1 HSPE1、MOB4的基因位置(綠色箭頭為轉(zhuǎn)錄方向)

圖2 數(shù)據(jù)庫已收錄的HSPE1和MOB4融合的位置

圖3 實驗所設(shè)計的HSPE1及MOB4的引物位置及方向

2.2 HSPE1-MOB4在細(xì)胞內(nèi)的表達位置細(xì)胞爬片免疫熒光實驗后在激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。HSPE1在細(xì)胞質(zhì)中表達，MOB4在細(xì)胞質(zhì)中和細(xì)胞核內(nèi)均有表達，融合蛋白HSPE1-MOB4在細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核內(nèi)均有表達。見圖7。

2.3 融合蛋白HSPE1-MOB4在細(xì)胞中的表達通過RT-PCR和Western blot實驗對8種細(xì)胞進行HSPE1-MOB表達水平的檢測，每種細(xì)胞實驗重復(fù)4次。結(jié)果顯示在所檢測的正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中細(xì)胞高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。在蛋白質(zhì)水平上，胃癌細(xì)胞中表達量較正常細(xì)胞高(t=5.079，P<0.01)，肝癌細(xì)胞中較正常細(xì)胞高(t=4.387，P<0.01)，卵巢癌細(xì)胞中較正常細(xì)胞高(t=4.630，P<0.01)，肺癌細(xì)胞中較正常細(xì)胞高(t=5.079，P<0.01)。見圖8。

圖4 HSPE1、MOB4及HSPE1-MOB4的瓊脂糖凝膠電泳圖

HSPE1，MOB4均有表達，且表達量未見明顯差異，HSPE1-MOB4在正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中也均有表達。在mRNA水平上，腫瘤細(xì)胞的表達量均較正常

圖5 HSPE1和MOB4的另一種融合位置

3 討論

真核生物轉(zhuǎn)錄是一個高度復(fù)雜的過程，基因組的重疊和其他復(fù)雜轉(zhuǎn)錄本正逐漸被意識到[1]，如通讀轉(zhuǎn)錄，連接或共轉(zhuǎn)錄的基因。融合蛋白是由兩個原本獨立的基因轉(zhuǎn)錄連讀產(chǎn)生的，這種新形成的蛋白一般具有新的特性，如新的細(xì)胞定位和新的生物功能[8]。

圖6 DNA測序峰圖

圖7 HSPE1、MOB4及融合蛋白HSPE1-MOB4兩種融合亞型在細(xì)胞內(nèi)的表達 ×40(oil)

HSPE1又稱HSP10，主要表達于線粒體中，近年來，超出“伴侶”的作用逐漸被報道，如參與免疫調(diào)節(jié)，細(xì)胞增殖分化[9]及癌變過程[10]。MOB4是沒有任何已知酶活性的球狀支架蛋白，在真核生物界中高度保守。有文獻[11]報道MOB4可通過絲、蘇氨酸激酶38 ，抑癌激酶激酶家族成員的調(diào)控作用而具有多種與癌癥相關(guān)的細(xì)胞功能。HSPE1-MOB4是由同位于2號染色體33.1區(qū)域的轉(zhuǎn)錄方向相同的兩基因轉(zhuǎn)錄嵌合后翻譯而成的天然融合蛋白。目前，已被報道的具有功能和可用性的天然融合蛋白的數(shù)量很少，而其中的大多數(shù)和腫瘤有相關(guān)性[12]。HSPE1和MOB4被報道和腫瘤相關(guān)，天然融合蛋白可能與腫瘤有關(guān)，由此推測HSPE1-MOB4可能也與腫瘤有關(guān)。

本研究在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平檢測到融合蛋白HSPE1-MOB4在腫瘤細(xì)胞中的表達量較對照組的正常細(xì)胞高。而在腫瘤細(xì)胞中有較高表達的蛋白往往具有成為腫瘤標(biāo)記的潛力。融合蛋白是一種特殊轉(zhuǎn)錄形式的產(chǎn)物，兩蛋白經(jīng)常(95%)被獨立翻譯，在某些情況下，才會連讀翻譯[1]，且已檢測到的大多融合蛋白有組織特異性，提示這種形式的蛋白可能有其內(nèi)在的意義，這一理論及研究結(jié)果均支持融合蛋白HSPE1-MOB4與腫瘤相關(guān)的猜想。測序發(fā)現(xiàn)的NCBI數(shù)據(jù)庫目前尚未收錄的新的融合亞型在正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中均有表達，且與已知亞型的表達位置相同，與單獨的HSPE1和MOB4相比較，HSPE1和MOB4蛋白的融合未出現(xiàn)新的蛋白質(zhì)定位，可能其特性是通過功能體現(xiàn)而不是定位。在生物進化的過程中每種成分都有其存在的功能和價值，且已發(fā)現(xiàn)的融合蛋白數(shù)量較少，故HSPE1-MOB4融合蛋白這種新的融合亞型可能也有其特殊的作用和意義。在有機體內(nèi)，不僅翻譯的產(chǎn)物蛋白質(zhì)可以發(fā)揮相應(yīng)的病理生理作用，轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物RNA也可以參與調(diào)節(jié)病理生理過程。連讀轉(zhuǎn)錄本這種特別的存在對于生物體而言可能有其獨特的意義。目前，已有報道稱在癌細(xì)胞中產(chǎn)生的連讀轉(zhuǎn)錄本可能和腫瘤有關(guān)，而在正常細(xì)胞中存在的通讀轉(zhuǎn)錄本可能和細(xì)胞應(yīng)激有關(guān)[8]。尚有文獻報道在腫瘤中檢測到連讀轉(zhuǎn)錄本，如乳腺癌，前列腺癌和胃癌，有實驗表明在腫瘤細(xì)胞系中沉默轉(zhuǎn)錄本可以減少癌細(xì)胞的增殖[13-15]，這提示癌組織中的連讀轉(zhuǎn)錄本可能具有致瘤性。HSPE1和MOB4的連讀轉(zhuǎn)錄本在腫瘤細(xì)胞中表達量較正常細(xì)胞高，也可能提示此連讀轉(zhuǎn)錄本與腫瘤間關(guān)系的潛在性，也可能是其發(fā)揮作用的一種形式。綜上所述，融合蛋白HSPE1-MOB4有新的融合亞型，在RNA水平和蛋白水平的表達增高可能與腫瘤相關(guān)。

圖8 HSPE1、MOB4及融合蛋白HSPE1-MOB4在腫瘤細(xì)胞中的表達