蕭正康，馬丹丹，李中虎，張智勇，蔡 遜

原發(fā)性肝癌是臨床中的常見惡性腫瘤。2018年公布的全球癌癥數(shù)據(jù)顯示，在統(tǒng)計的185個國家36種惡性腫瘤中，肝癌新發(fā)病例數(shù)高達(dá)84.1萬例，排名第7位；死亡病例數(shù)78.1萬例，僅次于肺癌與胃癌[1]。肝癌具有早期癥狀不明顯、進展迅速、治療困難、預(yù)后不佳的特點。盡管目前有手術(shù)治療、介入治療、靶向治療等多種手段，肝癌的治療效果及預(yù)后仍然欠佳。因此尋找肝癌相關(guān)差異基因和新的腫瘤基因治療靶點顯得尤為迫切。

FAM72A(family with sequence similarity 72 member A)又稱p17、LMPIP或Ugene，由149個氨基酸組成，是一種神經(jīng)元蛋白，在生理條件下在其他組織中表達(dá)極低。既往研究[2-5]表明FAM72A與非神經(jīng)組織的腫瘤如結(jié)腸癌、乳腺癌、肺癌等多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后相關(guān)。但目前其在肝癌中的表達(dá)及功能尚不明確，該研究將結(jié)合多個數(shù)據(jù)庫分析FAM72A在肝癌中的表達(dá)及意義。

1 材料與方法

1.1 人類蛋白圖譜數(shù)據(jù)庫分析利用人類蛋白圖譜數(shù)據(jù)庫(human protein atlas，HPA)檢索FAM72A在細(xì)胞中的表達(dá)情況。HPA提供24 000種人類蛋白質(zhì)的組織和細(xì)胞分布信息，利用免疫組化技術(shù)檢測每一種蛋白質(zhì)在正常組織、腫瘤組織中的表達(dá)分布，并經(jīng)過專業(yè)人員閱讀和標(biāo)引。在HPA中的”tissue”及”cell”選項卡中分別檢索“FAM72A”，獲得FAM72A在人正常組織中的表達(dá)概況和在腫瘤細(xì)胞中的定位。

1.2 基因差異表達(dá)分析利用GEPIA數(shù)據(jù)庫(gene expression profiling interactive analysis)及Oncomine數(shù)據(jù)庫檢索FAM72A在肝癌組織及癌旁組織中的表達(dá)差異。GEPIA是由北京大學(xué)開發(fā)的基于癌癥基因圖譜(the cancer genome atlas, TCGA)數(shù)據(jù)庫的在線數(shù)據(jù)分析網(wǎng)站。在GEPIA中檢索“FAM72A”基因，在“expression diy”選項卡中選擇”boxplot”，然后篩選腫瘤類型“LIHC”獲得肝癌組織與正常肝組織中的表達(dá)結(jié)果。Oncomine整合了高通量基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(gene expression omnibus，GEO)、TCGA數(shù)據(jù)庫和GTEx數(shù)據(jù)庫(the genotype-tissue expression)來源的數(shù)據(jù)。它是目前最大的腫瘤基因芯片數(shù)據(jù)庫和整合數(shù)據(jù)平臺。在Oncomine數(shù)據(jù)庫中篩選“FAM72A”基因，設(shè)定條件為“normal vs cancer”，選定腫瘤類型為“l(fā)iver cancer”，可以獲得各個子研究中肝癌組織與正常組織中的表達(dá)情況，并進行薈萃分析。

1.3 FAM72A表達(dá)量與病理特征的關(guān)系LinkedOmics數(shù)據(jù)庫是基于包含TCGA在內(nèi)的多數(shù)據(jù)庫的在線分析平臺，可用于分析基因的mRNA、蛋白表達(dá)、目的基因與臨床病理特征關(guān)系、甲基化等數(shù)據(jù)。本研究利用LinkedOmics數(shù)據(jù)庫分析TCGA數(shù)據(jù)庫中肝癌患者病理特征與FAM72A表達(dá)水平的關(guān)系。

1.4 生存分析Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫分析目的基因相關(guān)生存預(yù)后。Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫是一個在線生存分析平臺，目前能夠評估5.4萬個基因在21種惡性腫瘤中的生存預(yù)后。在Kaplan-Meier Plotter中選擇”mRNA-seq”中的“l(fā)iver-caner”數(shù)據(jù)庫，檢索”FAM72A”基因，選擇腫瘤類型“l(fā)iver hepatocellular carcinoma”，選擇按中位數(shù)“median”進行分組。分別繪制肝癌中FAM72A高、低表達(dá)組患者的生存曲線。

1.5 FAM72A在肝癌組織中的共表達(dá)基因cBioPortal數(shù)據(jù)庫(cBio Cancer Genomics Portal)是一個可視化、多維度分析癌癥基因組數(shù)據(jù)網(wǎng)站。整合了miRNA表達(dá)、DNA甲基化等多種數(shù)據(jù)類型。本研究利用其分析TCGA數(shù)據(jù)庫中FAM72A在肝癌組織中的共表達(dá)基因(spearman相關(guān)系數(shù)的>0.3為正相關(guān)，>0.8為高度正相關(guān))。

1.6 FAM72A共表達(dá)基因的GO富集功能分析及KEGG通路富集分析DAVID數(shù)據(jù)庫(The Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery)整合了生物學(xué)數(shù)據(jù)和分析工具，提供系統(tǒng)綜合的生物功能注釋信息。將與FAM72A正相關(guān)的共表達(dá)基因行GO生物途徑聚類分析和KEGG通路富集分析。

1.7 FAM72A共表達(dá)基因集的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建String數(shù)據(jù)庫目前收錄了5 090個物種，2 460萬種蛋白質(zhì)相互作用的信息。這些聯(lián)系中有實驗證實的，也有數(shù)據(jù)預(yù)測的結(jié)果。在STRING數(shù)據(jù)庫中搜索蛋白質(zhì)名稱“FAM72A”，選擇物種“Homo sapiens”，獲得FAM72A在人類細(xì)胞中的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò),同時STRING數(shù)據(jù)庫將根據(jù)文獻報道、數(shù)據(jù)庫收錄的數(shù)據(jù)、分子間共表達(dá)相關(guān)性等多方面證據(jù)預(yù)測蛋白分子間是否存在相互作用，并給出綜合得分(score)，分?jǐn)?shù)越接近1，分子間存在相互作用的可信度越大。分?jǐn)?shù)越接近0說明目前證據(jù)不足，可信度越低。使用STRING數(shù)據(jù)的“Multiple Proteins Search”功能構(gòu)建人肝癌組織中與FAM72A表達(dá)高度正相關(guān)(spearman相關(guān)系數(shù)>0.8)的共表達(dá)分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理本研究利用相應(yīng)數(shù)據(jù)庫提供的在線分析平臺進行統(tǒng)計學(xué)分析，兩組間差異的比較采用wilcox檢驗。多組連續(xù)型獨立樣本的比較采用Kruskal-Wallis檢驗。等級資料的相關(guān)分析采用spearman秩相關(guān)檢驗。生存分析以Kaplan-Meier法繪制患者生存曲線，采用Log-rank檢驗進行組間比較。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FAM72A在人體組織中及腫瘤細(xì)胞中的整體表達(dá)概況HPA數(shù)據(jù)庫顯示在統(tǒng)計的43種人體組織中，F(xiàn)AM72A mRNA高表達(dá)的組織器官前三位分別為淋巴結(jié)(pTPM=19.3)、睪丸(pTPM=15.9)及脾臟(pTPM=12.5)，在肝臟(pTPM=1.1)中的表達(dá)僅排名第35位(圖1)。提示在人正常肝組織中FAM72A低表達(dá)。進一步分析FAM72A在多種腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)定位，結(jié)果提示FAM72A表達(dá)于囊泡、細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)中(圖2)。

圖1 FAM72A在人體不同正常組織及器官中的表達(dá)

圖2 腫瘤細(xì)胞中FAM72A的表達(dá)定位

2.2 FAM72A在肝細(xì)胞癌及正常肝組織中的表達(dá)差異通過GEPIA分析TCGA數(shù)據(jù)庫及GTEx數(shù)據(jù)庫中合計369個肝癌樣本及160個正常肝組織樣本中FAM72A的表達(dá)水平，結(jié)果顯示肝癌組織中的FAM72A表達(dá)水平較正常肝組織升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(Log2FC Cutoff=0.8,P<0.001)。進一步通過Oncomine數(shù)據(jù)庫驗證，數(shù)據(jù)庫中有3項子研究符合篩選條件。3項子研究分別為Guichar Liver、Guichar Liver2[6]及TCGA Liver，共包含221個肝癌組織樣本及171個正常肝組織樣本。對其進行薈萃分析，結(jié)果顯示FAM72A在肝癌組織中的表達(dá)水平高于正常肝組織(P=2.49×10-18)。見圖3。

圖3 FAM72A在人肝癌組織中的表達(dá)與人正常肝組織間的表達(dá)差異

2.3 FAM72A的表達(dá)與肝癌患者臨床病理特征間的聯(lián)系LinkedOmics分析結(jié)果[7]如表1及圖4所示，F(xiàn)AM72A表達(dá)量與患者年齡(spearman correlation，P=6.792×10-3)、病理分期(Kruskal-Wallis Test，P=1.817×10-2)、T分期(Kruskal-Wallis Test，P=2.153×10-2)、人種(Kruskal-Wallis Test，P=3.379×10-2)相關(guān)，與N分期(Wilcox Test,P=5.228×10-1)、M分期(Wilcox Test,P=5.930×10-1)等無關(guān)。

表1 FAM72A在人肝癌中的表達(dá)量與臨床病理特征的關(guān)系

圖4 FAM72A在人肝癌中的表達(dá)量與臨床病理特征的關(guān)系

2.4 FAM72A表達(dá)水平與患者生存預(yù)后關(guān)系Kaplan-Meier Plotter結(jié)果顯示在全部364個臨床病例中，F(xiàn)AM72A高表達(dá)組患者與低表達(dá)組患者相比，其預(yù)后生存更差，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000 12)。其中低表達(dá)組患者中位生存期為71.0個月，而高表達(dá)組患者中位生存期僅為37.8個月(圖5)。

圖5 FAM72A高表達(dá)組患者與低表達(dá)組患者的生存曲線

2.5 尋找肝癌組織中FAM72A的共表達(dá)的基因cBioportal搜索結(jié)果中spearman秩相關(guān)系數(shù)大于0.3的共表達(dá)基因共有1 871個。其中高度正相關(guān)的共表達(dá)基因(spearman秩相關(guān)系數(shù)>0.8)有KIF14(rs=0.862)、NEK2(rs=0.856)、CENFP(rs=0.854)、FAM72D(rs=852)、FAM72B(rs=0.850)、NUF2(rs=0.841)、TOP2A(rs=829)、ANLN(rs=0.826)、SOG1(rs=0.820)及CDCA8(rs=0.801)等27個基因。

2.6 利用DAVID進行共表達(dá)基因的GO富集功能注釋及KEGG通路富集分析結(jié)果顯示1 871個共表達(dá)基因中，有1 833個被收錄于DAVID數(shù)據(jù)庫。對其進行GO生物途經(jīng)聚類分析，共表達(dá)基因主要參與DNA轉(zhuǎn)錄、DNA轉(zhuǎn)錄的調(diào)控、細(xì)胞分裂、細(xì)胞核分裂等過程(FDR<0.05)(圖6)。KEGG通路富集分析顯示這些基因參與了細(xì)胞周期、RNA轉(zhuǎn)運、剪接體、DNA復(fù)制、P53信號通路、堿基切除修復(fù)等相關(guān)通路(FDR<0.05)(圖7)。

圖6 共表達(dá)基因集的GO生物途徑聚類分析

圖7 共表達(dá)基因集的KEGG通路富集分析

2.7 String數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站分析人源FAM72A可能存在的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)結(jié)果顯示，在人類細(xì)胞中與FAM72A蛋白相互作用的蛋白網(wǎng)絡(luò)中共有10個蛋白(P=0.0151)。分別為DCLRE1B(score=0.562)、AURKA(score=0.554)、FAM115C(score=0.544)、C1orf74(score=0.479)、NDC80(score=0.469)、CDCA8(score=0.452)、TTK(score=0.439)、ADORA3(score=0.437)、AURKB(score=0.430)、UBALD2(score=0.420)；其中FAM72A與DCLRE1B及AURKA的綜合得分最高(圖8)。進一步建立FAM72A在肝癌中高度相關(guān)的共表達(dá)分子的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。見圖9。

圖8 FAM72A在人細(xì)胞中存在的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)

圖9 FAM72A在人肝癌組織中高度正相關(guān)的共表達(dá)分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

3 討論

FAM72A在多種腫瘤中出現(xiàn)表達(dá)升高。目前研究[4]表明FAM72A可以與堿基切除修復(fù)蛋白UNG2的NH2末端結(jié)合，而UNG2的NH2末端已經(jīng)被證明可以與PPM1D磷酸酯酶相互作用從而抑制堿基切除修復(fù)[8]，但目前體外實驗尚未能證明FAM72A能夠直接調(diào)控UNG2的酶活性。其在肝癌中的作用尚不明確，需要進一步研究FAM72A在腫瘤中的作用。

本研究通過利用多個數(shù)據(jù)庫分析了FAM72A在肝癌中的表達(dá)及意義。首先HPA數(shù)據(jù)庫顯示FAM72A在正常肝組織中低表達(dá),其在腫瘤細(xì)胞中主要定位于囊泡、細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)。其次Oncomine數(shù)據(jù)庫及GEPIA分析包含TCGA數(shù)據(jù)庫在內(nèi)的多項研究數(shù)據(jù)均顯示肝癌中FAM72A的mRNA表達(dá)水平升高。利用了LinkeOmics平臺分析結(jié)果顯示FAM72A的表達(dá)與肝癌患者的部分病理特征相關(guān)。FAM72A表達(dá)水平與人種及年齡相關(guān)且FAM72A高表達(dá)的患者其病理分期更晚。但結(jié)果并未提示FAM72A高表達(dá)肝癌患者更容易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，這可能是由于數(shù)據(jù)庫中遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者病例數(shù)較少。為了探究FAM72A表達(dá)與肝癌患者的生存預(yù)后關(guān)系，本研究組通過Kaplan-Meier Plotter繪制了FAM72A高表達(dá)組與低表達(dá)組的生存曲線。結(jié)果顯示肝癌患者中FAM72A高表達(dá)組的中位生存時間較低表達(dá)組縮短。FAM72A高表達(dá)提示肝癌患者的預(yù)后生存更差。FAM72A有可能作為判斷肝癌患者預(yù)后的新指標(biāo)。

為了尋找FAM72蛋白在人細(xì)胞中相互作用的蛋白，本研究組利用STRING數(shù)據(jù)庫查找與FAM72A相互作用的蛋白。發(fā)現(xiàn)在人細(xì)胞中與FAM72A直接相互作用的蛋白有DCLRE1B、AURKA、FAM115C等10個蛋白，其中FAM72A與DCLRE1B與AURKA相關(guān)性最高。DCLRE1B(又稱APOLLO或SNM1B，目前研究顯示其與DNA損傷反應(yīng)及和維持染色體端粒穩(wěn)定性上有著重要作用[9-10]。而AURKA則編碼的是一種定位在中心體上的絲氨酸/蘇氨酸激酶。該蛋白在細(xì)胞的有絲分裂中通過參與中心體的復(fù)制、分離和成熟等過程，對染色體平均分配到兩個子代細(xì)胞起著重要的作用[11-12]。有研究[13]表明，過表達(dá)AURKA基因可導(dǎo)致染色體不穩(wěn)定、促進細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化。后續(xù)還需要更多的研究來探索FAM72A與它們之間的作用方式。

同時本研究組利用了cBioPortal在分析了TCGA數(shù)據(jù)庫中的372個病例及其基因芯片數(shù)據(jù)，以此尋找在肝癌組織中可能與FAM72A共同作用的共表達(dá)基因。最后獲得了肝癌中FAM72A的1871個共表達(dá)基因。為了進一步了解這些基因在肝癌組織中主要參與了哪些生物途經(jīng)及通路。本次研究使用DAVID數(shù)據(jù)庫對這些基因進行了聚類分析。數(shù)據(jù)庫顯示包含F(xiàn)AM72A在內(nèi)的這些共表達(dá)基因主要參與了DNA轉(zhuǎn)錄、DNA轉(zhuǎn)錄的調(diào)控、細(xì)胞分裂、細(xì)胞核分裂、RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄的負(fù)調(diào)控、DNA復(fù)制、DNA修復(fù)等重要途徑。提示了這些共表達(dá)基因在維持正常細(xì)胞分裂、DNA復(fù)制及轉(zhuǎn)錄的過程中共同發(fā)揮著重要的作用。通過KEGG通路富集分析，本研究發(fā)現(xiàn)了這些基因參與了細(xì)胞周期調(diào)控、RNA轉(zhuǎn)運、DNA復(fù)制、堿基切除修復(fù)以及P53信號等通路。進一步提示這些共表達(dá)基因參與細(xì)胞的增殖、腫瘤發(fā)生過程中的多個相關(guān)通路。

最后為了研究肝癌組織中FAM72A共表達(dá)分子間的相互作用關(guān)系。本研究組選取了與FAM72A高度正相關(guān)的27個共表達(dá)分子，利用STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建了它們之間的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。數(shù)據(jù)庫推測這些高度相關(guān)共表達(dá)分子中CDCA8可能與FAM72A間存在直接作用關(guān)系。CDCA8又稱人類細(xì)胞分裂周期相關(guān)基因8，其編碼的蛋白稱為Borealin。目前研究發(fā)現(xiàn)它與INCENP和Survivin共同構(gòu)成了染色體移動復(fù)合物(chromosomal passenger complex, CPC)。CDCA8在腫瘤及未分化的人細(xì)胞中呈高表達(dá)，但在其他正常細(xì)胞中低表達(dá)或無表達(dá)。Borealin在穩(wěn)定雙極紡錘體、矯正動粒結(jié)合位點、定位染色體移動復(fù)合物到著絲粒方面等起著重要的作用[14]。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)CDCA8在肝細(xì)胞癌中出現(xiàn)表達(dá)上調(diào)，且與腫瘤分化程度、腫瘤分期、腫瘤復(fù)發(fā)等因素相關(guān)，而高表達(dá)CDCA8的患者預(yù)后生存更差[15]。FAM72A與CDCA8的表達(dá)高度相關(guān)(rs=0.801)，但目前尚無實驗和文獻報道兩者間的作用關(guān)系。本研究根據(jù)STRING數(shù)據(jù)庫結(jié)果推測CDCA8可能是FAM72A參與共表達(dá)分子網(wǎng)絡(luò)功能的重要節(jié)點。

綜上，本研究組綜合利用了多個數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)FAM72A在肝癌中高表達(dá)且其高表達(dá)FAM72A的患者預(yù)后及病理分期更差。FAM72A有可能成為判斷肝癌患者預(yù)后的新標(biāo)志物。本研究初步探索了FAM72A及其共表達(dá)基因在肝癌組織中可能參與的生物途經(jīng)、通路。構(gòu)建共表達(dá)分子之間的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為后續(xù)研究FAM72A在肝癌中的作用提供了思路和方向。