劉大潮，吳文涌，吳正升

我國罹患惡性腫瘤的患者中，肝癌的發(fā)病率排在第3位，病死率處于第2位[1]。最新公布的數(shù)據(jù)表明，在所有惡性腫瘤疾病中，新發(fā)肝癌患者人數(shù)排名第6[2]。肝細(xì)胞性肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)作為肝癌中最常見的組織學(xué)亞型，人們對HCC的研究也進(jìn)一步深入，信號通路在HCC的進(jìn)程中扮演了重要的角色[3-5]。GSE1螺旋蛋白(Gse1 coiled-coil protein,GSE1)是一種富脯氨酸蛋白質(zhì)，在研究中被發(fā)現(xiàn)可以促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[6]，并且和人胃癌臨床病理及預(yù)后情況密切相關(guān)[7]。但是對于GSE1在HCC的表達(dá)情況，國內(nèi)外文獻(xiàn)目前尚未發(fā)現(xiàn)報道。因此該研究對HCC組織進(jìn)行GSE1的檢測，從蛋白及mRNA水平探討GSE1在臨床樣本中的表達(dá)情況，并分析其與HCC臨床病理特征的關(guān)系，為HCC患者的疾病發(fā)展機(jī)制及潛在的治療方法提供新的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料收集安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科2012年1月～2013年12月HCC的石蠟包埋標(biāo)本71例，同時選取癌旁的非腫瘤組織41例作為對照組。在上述病例中，女性患者共計(jì)12例，男性患者共計(jì)59例，患者年齡27～78(54.06±10.63)歲。癌腫直徑≤5 cm 33例；>5 cm 38例；脈管浸潤16例；無脈管浸潤55例。在本實(shí)驗(yàn)中，依據(jù)國際抗癌聯(lián)盟(Union for International Cancer Control,UICC)所制定的TNM分期系統(tǒng)[8]，對患者臨床標(biāo)本進(jìn)行病理分期；分級采用Edmondson分級法。依據(jù)雙盲原則，邀請2名讀片經(jīng)驗(yàn)豐富的病理醫(yī)師對結(jié)果進(jìn)行評定。

新鮮標(biāo)本收集于安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院2019年5月～9月經(jīng)手術(shù)切除的30對HCC及癌旁非腫瘤組織標(biāo)本(HCC診斷經(jīng)明確病理證實(shí))。標(biāo)本離體后0.5 h內(nèi)置入液氮速凍，續(xù)置入-80 ℃冰箱凍存。

1.2 主要試劑和儀器實(shí)時熒光定量PCR試劑盒及RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自全式金生物公司；兔抗人GSE1抗體購自美國proteintech公司，工作滴度1 ∶200；RIPA蛋白裂解液購自武漢BOSTER生物工程公司；聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)購自上海羅氏公司；電化學(xué)發(fā)光液(electrochemiluminescence，ECL)購自上海拜力(Pierce)生物科技有限公司；小鼠/兔聚合物法檢測系統(tǒng)(PV-6000)及DAB顯色試劑盒(ZLI-9018)購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1免疫組化方法 免疫組化使用EnVision法。所需臨床標(biāo)本在術(shù)中取下后均使用10%福爾馬林溶液固定24 h，石蠟包埋機(jī)包埋組織，切片機(jī)切片厚度為4 μm，石蠟切片烤片后依下列順序過缸脫蠟：二甲苯(10 min)2遍→無水乙醇(5 min)2遍→95%乙醇(5 min)1遍→90%乙醇(5 min)1遍→80%乙醇(5 min)1遍→70%乙醇(5 min)1遍→蒸餾水(5 min)。隨后放置于加有抗原修復(fù)液(檸檬酸鈉溶液)的容器內(nèi)高壓加熱進(jìn)行抗原修復(fù)120 s，取片靜置至室溫，并滴加3% H2O2作用10 min。滴加一抗后置入4 ℃冰箱中過夜，待孵育完成后滴入二抗50 μl，置入37 ℃溫箱中孵育30 min，最后在避光環(huán)境下滴加DAB顯色，顯色情況在光學(xué)顯微鏡下觀測，待顯色完全，流水沖洗終止顯色反應(yīng)，再使用蘇木素染色液對切片復(fù)染，脫水后中性樹脂封片，在光學(xué)顯微鏡下觀察染色情況。

1.3.2提取RNA和qRT-PCR檢測 使用TRIzol試劑從待檢測組織中提取總RNA，cDNA制備工作在逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑盒的說明書指導(dǎo)下完成，qPCR檢測以上述步驟所得cDNA為模板進(jìn)行。將GAPDH作為內(nèi)參，同時每組設(shè)定3個平行副孔。引物均由上海生工生物公司合成，qRT-PCR引物序列如下：GAPDH上游:5′-AGCAAGAGCACAAGAGGAAG3′,GAPDH下游:5′-GGTTGAGCACAGGGTACTTT3′;GSE1上游:5′-ATGGTGTCTGGAGGAGTGAGAGC-3′,GSE1下游:5′-AGGTCGTCGGTGGTGTGGTAG-3′。實(shí)驗(yàn)步驟如下：94 ℃下預(yù)變性、變性，后60 ℃退火延伸，重復(fù)循環(huán)40次，繼而進(jìn)行融解曲線反應(yīng)，基因樣本的擴(kuò)增Ct值經(jīng)由軟件分析并導(dǎo)出，記錄所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1.3.3蛋白提取和Western blot檢測 收集新鮮組織并用蛋白裂解液裂解后提取蛋白，使用10% SDS-PAGE凝膠電泳，在300 mA恒流條件下轉(zhuǎn)膜90 min，漿膜置于濃度為5%脫脂牛奶中，室溫下?lián)u床封閉1 h，TBST洗膜3次，4 ℃冰箱內(nèi)一抗孵育過夜；TBST洗膜后加入二抗，37 ℃溫箱內(nèi)孵育1 h，洗膜后配置ECL液進(jìn)行檢測。

1.4 結(jié)果判定GSE1免疫反應(yīng)陽性以細(xì)胞質(zhì)中即見棕黃色顆粒狀物質(zhì)沉積作為判斷并進(jìn)行計(jì)數(shù)，并隨機(jī)選擇5個不重復(fù)的視野對免疫組化切片進(jìn)行觀察，對所挑選的每個視野范圍內(nèi)對細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。依據(jù)半定量積分法對最終結(jié)果進(jìn)行判斷，并由2名資深病理科醫(yī)師完成打分，標(biāo)準(zhǔn)如下：① 依照反應(yīng)著色強(qiáng)度打分。0分：細(xì)胞無明顯的著色反應(yīng)；1分：淺黃色；2分：棕黃色；3分：棕褐色。② 依照同一視野下陽性細(xì)胞個數(shù)占觀測所得細(xì)胞總數(shù)比例進(jìn)行打分。0分：視野中未發(fā)現(xiàn)陽性細(xì)胞；1分：陽性細(xì)胞所占比率≤10%；2分：陽性細(xì)胞所占比率為11%～50%；3分：陽性細(xì)胞所占比率51%～75%；4分：陽性細(xì)胞所占比率>75%。將上述各切片打分后的① ②兩項(xiàng)得分相乘，依據(jù)相乘后所得的分?jǐn)?shù)將結(jié)果劃分為4個等級：“-”：≤2分；“+”： 3～4分；“2+”：6～8分；“3+”：≥9分，依所得分?jǐn)?shù)判定≥6分為反應(yīng)陽性[9]。

2 結(jié)果

2.1 GSE1在HCC組織及癌旁非腫瘤組織中的表達(dá)本實(shí)驗(yàn)收集30組新鮮HCC和30組癌旁非腫瘤組織進(jìn)行qRT-PCR實(shí)驗(yàn)，測定GSE1 mRNA在不同組織中的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)HCC組中GSE1的mRNA表達(dá)與癌旁非腫瘤組織相比上調(diào)(P<0.000 1)，見圖1。接著運(yùn)用Western blot實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步檢測GSE1在實(shí)驗(yàn)組和對照中的表達(dá)情況，結(jié)果表明在HCC組織中GSE1的表達(dá)上調(diào)，見圖2。

圖1 GSE1 mRNA在HCC組織及癌旁非腫瘤組織中的表達(dá)

圖2 GSE1蛋白在HCC組織及癌旁非腫瘤組織中的表達(dá)

在免疫組化實(shí)驗(yàn)中，GSE1的表達(dá)定位于細(xì)胞質(zhì)，見圖3。GSE1蛋白在71例HCC組織中陽性率為50.70%(36/71)，41例癌旁非腫瘤組織陽性率為19.51%(8/41)。GSE1蛋白在HCC組織與癌旁非腫瘤組織中的表達(dá)存在差異(P<0.05)，見表1。

圖3 GSE1在不同肝組織中的表達(dá)

表1 GSE1在不同肝組織中的表達(dá)

2.2 GSE1蛋白在HCC組織中的表達(dá)結(jié)果與臨床病理參數(shù)之間的相關(guān)性在HCC組織中，GSE1蛋白水平的變化與TNM分期相關(guān)(P<0.01)，與統(tǒng)計(jì)的其余參數(shù)均未見相關(guān)，見表2。

3 討論

惡性腫瘤發(fā)生的根本原因包括了原癌基因的激活和抑癌基因功能的喪失。HCC作為肝癌中最為常見的組織學(xué)亞型，其預(yù)后不佳，經(jīng)統(tǒng)計(jì)患者5年生存率不足15%[10]，因此對可能參與到HCC進(jìn)展過程中關(guān)鍵因素的研究十分重要。既往的研究中Yao et al[11]發(fā)現(xiàn)ASB16-AS1可作為癌基因調(diào)節(jié)miR-1827/FZD4/Wnt/β-catenin途徑促進(jìn)HCC的進(jìn)程；Salah et al[12]則發(fā)現(xiàn)MiR-34a可作為抑癌基因并能被制成納米制劑用于HCC的治療。而對于早期HCC患者，經(jīng)射頻消融治療的短期生存率優(yōu)異[13]。

GSE1是一種富脯氨酸蛋白質(zhì)，分子量136 ku[14]，首次Nagase et al[15]通過使用離子阱質(zhì)譜法被分離和鑒定，定位于16q24.1。Chai et al[6]在GSE1的研究中發(fā)現(xiàn)GSE1在體外可以介導(dǎo)乳腺癌的進(jìn)展。通過實(shí)驗(yàn)證明了GSE1在乳腺癌中高表達(dá)，siRNA對乳腺癌細(xì)胞系GSE1基因敲除抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。通過qRT-PCR對新鮮冰凍乳腺癌組織進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)，miR-489-5p在乳腺癌組織中的表達(dá)減少。此外，miR-489-5p的高表達(dá)抑制了乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，并且miR-489-5p的靶基因是GSE1。同時Ding et al[7]在對GSE1的進(jìn)一步研究中，選取了100組人胃癌組織和正常胃組織進(jìn)行免疫組化實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)相比于正常組織，胃癌組織中高表達(dá)，并對上述100名胃癌患者臨床病理數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)GSE1的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期相關(guān)，對患者術(shù)后5年隨訪調(diào)查發(fā)現(xiàn)，胃癌組織中GSE1高表達(dá)患者的無復(fù)發(fā)生存率及總生存率均低于低表達(dá)組，這些數(shù)據(jù)表明GSE1與胃癌患者的預(yù)后不良有關(guān)。

表2 GSE1在HCC中的表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

本研究檢測首先使用qRT-PCR方法檢測GSE1 mRNA在新鮮HCC組織及癌旁非腫瘤組織中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，GSE1在HCC組織中的表達(dá)上調(diào)；接著使用Western blot檢測GSE1蛋白在新鮮HCC組織及癌旁非腫瘤組織中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，GSE1蛋白在HCC組織中表達(dá)水平較高；最后使用免疫組化的方法測定GSE1在石蠟樣本中的表達(dá)，結(jié)果顯示GSE1在HCC組織中表達(dá)上調(diào)且GSE1的高表達(dá)與HCC的臨床分期正相關(guān)。這與Ding et al[7]在胃惡性腫瘤研究結(jié)果相一致，提示了GSE1可能扮演著癌基因的角色。