楊本軍，武明飛，徐 濤

急性肺損傷(acute lung injury, ALI)是一種具有高發(fā)病率和死亡率的急性炎癥性疾病[1]。ALI直接或間接由肺炎、吸入性損傷、溺水等引起，其臨床表現(xiàn)包括肺水腫、呼吸困難、低氧血癥[2]。雖然針對ALI已經(jīng)進(jìn)行了很多研究，但到目前為止，還沒有發(fā)現(xiàn)有效的治療藥物[3]。越來越多的研究[4]表明，抑制炎性細(xì)胞因子的過度分泌被視為治療ALI的有效策略。

連翹是我國40種常用大宗中藥材之一，具有抗氧化、保肝、降血脂等多種活性。連翹苷(phillyrin，PHN) 為連翹的干燥果實(shí)的提取物，是由兩分子苯丙素側(cè)鏈相互連接形成兩個環(huán)氧結(jié)構(gòu)的一類木脂素。其結(jié)構(gòu)上連橋是多種天然產(chǎn)物單體發(fā)揮抗氧化，抗菌和抗炎作用中起著重要基團(tuán)之一[5]?；谶@一特點(diǎn)，在本研究中使用細(xì)胞和動物模型研究PHN抗炎活性和初步分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料PHN購自阿拉丁試劑(上海)有限公司；脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)購自美國 Sigma-Aldrich公司；小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7作為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株來自安徽醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院；PBS緩沖液、培養(yǎng)基(DMEM)和胎牛血清購自美國Thermo Fisher Scientific公司；10% FBS購自以色列Biological Industries公司;一氧化氮(NO)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；白介素-6(interleukin-6，IL-6)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor α，TNF-α)酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA) 檢測試劑盒購自杭州聯(lián)科生物有公司；一抗購自美國Cell Signaling Technology公司；、二抗、TBST、RIPA裂解緩沖液購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；PVDF膜購自杭州聯(lián)科美訊生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司；酶標(biāo)儀(型號：MQX200，Bio-Tek)；分子對接軟件Discovery Studio(型號：2017 R2，BIOVIA Software)；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 將RAW264.7細(xì)胞在含有10% FBS、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的DMEM中,于37 ℃下，在含有5% CO2的培養(yǎng)條件中培養(yǎng)。

1.2.2炎性細(xì)胞因子的測定 將生長狀態(tài)良好的對數(shù)期RAW264.7細(xì)胞(細(xì)胞密度：6×104個細(xì)胞/孔)接種到48孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，并在培養(yǎng)箱中孵育24 h。棄去培養(yǎng)基，用不同濃度的PHN及陽性對照藥物塞來昔布(celecoxib) 預(yù)處理細(xì)胞1 h，然后在LPS(0.5 μg/ ml)誘導(dǎo)下溫育24 h。收集上清液，并使用按照NO試劑盒Griess試劑檢測NO含量。按照ELISA試劑盒說明書，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作測定上清液中TNF-α、IL-6 細(xì)胞因子的分泌水平。

1.2.3細(xì)胞毒性測定 將生長狀態(tài)良好的對數(shù)期RAW264.7細(xì)胞(細(xì)胞密度：6×103個細(xì)胞/孔)接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，培養(yǎng)箱中孵育24 h。棄去培養(yǎng)基，用不同濃度的PHN及陽性對照藥物塞來昔布(10、20、30 μmol/L)預(yù)處理細(xì)胞1 h，然后與LPS(0.5 μg/ml)一起在培養(yǎng)箱中溫育24 h。通過MTT方法測試細(xì)活力，具體的方法：棄去培養(yǎng)基，向每個孔中加入MTT溶液(在PBS中5 mg/ml)并在37 ℃下孵育4 h。除去含MTT的培養(yǎng)基，然后加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)溶液，置于搖床上振蕩30 min。通過酶標(biāo)儀在492 nm處檢測吸光度，并計算細(xì)胞增殖率。

1.2.4Western blot檢測 將生長狀態(tài)良好的對數(shù)期RAW264.7細(xì)胞(細(xì)胞密度：3×105個細(xì)胞/孔)接種到6孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，然后培養(yǎng)24 h。棄去培養(yǎng)基，用不同濃度的PHN(1.25、2.5、5、10 μmol/L)預(yù)處理細(xì)胞12 h，然后與LPS(0.5 μg/ml)一起在培養(yǎng)箱中溫育1 h后提取細(xì)胞總蛋白。用含有PMSF和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解緩沖液裂解細(xì)胞，然后在冰上孵育30 min。通過12% SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)裂解物，隨后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。將封閉的膜與指定的一抗(以抗體 ∶5% BSA溶液1 ∶1 000稀釋)在4 ℃溫育過夜。用TBST洗滌3次后，將膜與HRP偶聯(lián)的二抗在室溫下孵育1 h，以GAPDH作為內(nèi)參。顯影并計算光密度值。

1.2.5分子對接 采用分子對接研究PHN與TLR4之間的潛在相互作用，使用Discovery Studio，軟件進(jìn)行模擬測試。TLR4蛋白(PDB代碼：2Z64)的X射線晶體結(jié)構(gòu)獲自RCSB蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫。將TLR4蛋白晶體結(jié)構(gòu)導(dǎo)入DS軟件中，對蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行去水、加氫處理，然后利用該軟件中的準(zhǔn)備蛋白工具對蛋白進(jìn)行處理。PHN結(jié)構(gòu)進(jìn)行能量最小化處理。使用CDOCKER模塊進(jìn)行分子對接研究。

1.2.6體內(nèi)實(shí)驗(yàn) 50只雄性C57BL/6小鼠(體重18～25 g)購自安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。將C57BL/6小鼠隨機(jī)分為5組(n=10)，分別對照組(生理鹽水)、模型組、PHN低劑量組、PHN中劑量組、PHN高劑量組。對照組小鼠正常飼養(yǎng)，除了對照組外，其余組通過尾靜脈注射20 mg/kg LPS。在注射LPS之前0.5 h，PHN低劑量組和PHN高劑量組通過腹膜內(nèi)注射分別給予濃度為10 mg/kg和20 mg/kg的PHN。在LPS注射后48 h對小鼠進(jìn)行麻醉并處死。收集肺組織并將其固定在4%多聚甲醛溶液中，然后包埋在石蠟中。脫水后用蘇木精和伊紅(HE)染色切片并進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。該研究經(jīng)安徽醫(yī)科大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 PHN抑制LPS誘導(dǎo)的NO釋放用LPS處理RAW 264.7細(xì)胞導(dǎo)致炎癥因子的分泌，包括NO、IL-6和TNF-α。與空白對照組相比，LPS模型組細(xì)胞上清液的NO含量明顯增加。PHN作用的細(xì)胞上清液中NO含量明顯低于LPS模型組。其中，當(dāng)濃度為10 μmol/L時，PHN對NO釋放的抑制率為63.34%；當(dāng)濃度為20 μmol/L時，抑制率為45.49%(P<0.05)(圖1)。

圖1 PHN對LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞中NO釋放的抑制率

2.2 細(xì)胞毒性評估為了避免對NO釋放的抑制作用與細(xì)胞活力相關(guān)，采用MTT測定法檢測不同濃度PHN及塞來昔布對細(xì)胞活力的影響。如圖2，PHN和陽性藥物在不同濃度范圍內(nèi)(10、20、30 μmol/L)對細(xì)胞增殖無明顯抑制作用，細(xì)胞存活率均大于95%，不同劑量的PHN組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果表明PHN的抗炎活性不是由細(xì)胞毒作用介導(dǎo)的。因此，PHN的抗炎作用機(jī)制值得進(jìn)一步探索。

圖2 PHN對RAW264.7細(xì)胞活力的影響

2.3 PHN抑制LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞因子分泌用PHN進(jìn)一步評估LPS誘導(dǎo)的TNF-α和IL-6分泌量的影響作用。當(dāng)予以0.625、1.25、2.5、5和10μmol/L PHN時，IL-6濃度分別降低到(840.66±8.09)、(781.67±13.59)、(644±13.45)、(516.66±44.09)和(452.66±23.56) pg/ml(圖3A)，TNF-α濃度分別降低到(2 255.67±67.36)、(2 037.66±42.31)、(1 691.66±13.19)、(1 493.66±39.57)和(1 294.33±84.68) pg/ml(圖3B)。該結(jié)果表明PHN以濃度依賴性方式降低IL-6和TNF-α分泌。

圖3 PHN對RAW264.7細(xì)胞中LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞因子分泌量的變化

2.4 PHN抑制LPS誘導(dǎo)的TLR4表達(dá)課題組研究了TLR4的表達(dá)是否受到PHN的調(diào)控。如圖4所示，LPS(0.5 mg/mL)刺激的RAW264.7細(xì)胞可顯著增強(qiáng)TLR4的表達(dá)。PHN通過以濃度依賴性方式，抑制了TLR4的表達(dá)水平。該結(jié)果再次證明PHN可以抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞中的炎性反應(yīng)。

圖4 PHN對LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞TLR4蛋白表達(dá)水平的影響

2.5 PHN結(jié)合TLR4的對接分析為了闡明PHN可以抑制炎性細(xì)胞因子分泌的機(jī)制，通過分子對接來研究PHN與TLR4(PDB代碼：2Z64)之間的結(jié)合模式。對接結(jié)果顯示，PHN與TLR4之間的結(jié)合能量最高打分為440.571 kJ/mol 如圖5所示，PHN通過與TLR4上的THR614和ASP619形成2個常規(guī)氫鍵，與GLU611、SER623、CYS580、ASP619和ASN622形成7個碳?xì)滏I，以及多個范德華力等。以上結(jié)果表明，PHN與TLR4的活性位點(diǎn)穩(wěn)定結(jié)合，兩者之間具有較好的親和力。

圖5 PHN插入TLR4活性位點(diǎn)的結(jié)合模式圖

2.6 PHN對LPS誘導(dǎo)的ALI小鼠的保護(hù)作用通過肺組織切片病理形態(tài)學(xué)變化評估PHN對LPS誘導(dǎo)的ALI小鼠模型的保護(hù)作用。如圖6所示，在正常小鼠中，肺泡結(jié)構(gòu)清晰、完整，肺泡腔內(nèi)無分泌物和炎性細(xì)胞浸潤。LPS刺激導(dǎo)致顯著的炎癥改變，用PHN預(yù)處理LPS誘導(dǎo)的肺損傷炎癥小鼠，則明顯地改善了肺組織病變，肺泡腔炎性細(xì)胞減少，肺小葉的組織結(jié)構(gòu)完整，并且低劑量組的改善作用優(yōu)于高劑量組。結(jié)果表明，PHN對LPS誘導(dǎo)ALI小鼠模型的組織病理損傷具有保護(hù)作用。

圖6 PHN改善LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷模型的病理變化HE染色×100

3 討論

當(dāng)受到外界刺激時，機(jī)體做出的適應(yīng)性反應(yīng)，如急性炎癥，是人體極為重要的病理過程。受到外界刺激后，炎性細(xì)胞主力軍之一的巨噬細(xì)胞會產(chǎn)生大量炎性因子促進(jìn)炎癥反應(yīng)和組織損傷[6]。促炎細(xì)胞因子在疾病的防御中發(fā)揮重要作用。然而，不受控制和過量釋放促炎介質(zhì)，如NO、IL-6、TNF-α、IL-1β等，可導(dǎo)致多種類型的炎癥性疾病，如ALI[7]。ALI是由于過度炎癥引起的嚴(yán)重疾病，表現(xiàn)為急性呼吸窘迫、非心源性肺水腫和低氧血癥[8]。已經(jīng)證實(shí)NO、TNF-α、IL-6等，通過一系列細(xì)胞信號通路調(diào)節(jié)ALI的發(fā)病進(jìn)程[9]。

LPS是革蘭陰性細(xì)菌主要的致病因子之一，可以引起人及動物多種急、慢性炎癥反應(yīng)，從而導(dǎo)致組織器官的損傷。據(jù)報道，液體咽后壁吸入LPS所造成的肺部炎癥比較均一穩(wěn)定，并且可以進(jìn)行定量研究[10-11]。其機(jī)制可能是LPS通過激活其主要受體TLR4起作用，觸發(fā)先天免疫系統(tǒng)，隨后激活MAPK以誘導(dǎo)釋放促炎細(xì)胞因子。在用LPS刺激后，TLR4啟動一系列信號級聯(lián)，導(dǎo)致MAPK的活化，從而誘導(dǎo)促炎性細(xì)胞因子如NO、TNF-α和IL-6的分泌[12]。

本研究采用LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞RAW264.7損傷模型，考察PHN對ALI的病程發(fā)展中起關(guān)鍵作用的各種炎性細(xì)胞因子，如NO、IL-6和TNF-α的變化影響。初步結(jié)果表明，與空白對照組比較，0.5 μg/ ml LPS能顯著提高NO、IL-6和TNF-α的分泌量(P<0.01)，說明細(xì)胞炎癥的模型成功建立；與模型組比較，PHN以劑量依賴性方式抑制NO、IL-6和TNF-α的分泌(P<0.05或P<0.01)。并且在30 μmol/L以下濃度范圍，PHN對細(xì)胞增殖無明顯抑制作用。初步機(jī)制探討，PHN以濃度依賴性方式通過抑制TLR4信號傳導(dǎo)途徑調(diào)節(jié)ALI的發(fā)病機(jī)制(P<0.05或P<0.01)。根據(jù)分子對接結(jié)果分析，PHN通過與TLR4上重要氨基酸殘基THR614、ASP619、GLU611等形成了9個牢固氫鍵，結(jié)合能量最高打分為440.571 kJ/mol。提示PHN與TLR4蛋白之間具有較強(qiáng)的親和力。通過肺組織病理檢查，LPS的吸入可導(dǎo)致小鼠出現(xiàn)嚴(yán)重的肺損傷，包括肺水腫、炎性細(xì)胞浸潤和肺泡結(jié)構(gòu)的破壞，說明小鼠急性肺炎模型的建立是成功的。在接受PHN治療后，小鼠的肺水腫開始趨于緩和，肺泡腔炎性細(xì)胞數(shù)量也較未接受治療的模型組有顯著降低，肺小葉的組織結(jié)構(gòu)完整，充血現(xiàn)象也有所減輕。本研究表明PHN在小鼠ALI模型中有效地減少了LPS誘導(dǎo)的肺部炎癥和急性肺損傷。

綜上所述，PHN可以有效地抑制LPS誘導(dǎo)的肺部感染引發(fā)的炎癥反應(yīng)的發(fā)展進(jìn)程，對急性炎癥導(dǎo)致的肺損傷有較顯著的保護(hù)作用，其機(jī)制可能是影響 TLR4信號通路，抑制RAW264.7細(xì)胞的相關(guān)炎性因子的分泌有關(guān)。因此，PHN在臨床ALI的治療中具有潛在的研究價值。