孔祥偉，劉向輝，程義成

外泌體是一類直徑40～150 nm 的膜性脂質(zhì)小囊泡，內(nèi)含功能性蛋白質(zhì)、mRNA、microRNA等物質(zhì)，在細胞間的信息傳遞過程中發(fā)揮重要作用[1]。1983年Harding et al[2]在大鼠的網(wǎng)織紅細胞中發(fā)現(xiàn)了一種由細胞分泌的小囊泡，1987年Johnstone et al[3]也在網(wǎng)織紅細胞中發(fā)現(xiàn)了這種雙層膜小囊泡并正式命名為外泌體。外泌體具有比細胞因子更強、更廣泛的信號分子轉(zhuǎn)運和調(diào)控能力。目前已經(jīng)從多種細胞的培養(yǎng)基中分離得到了外泌體，如巨噬細胞、T細胞、間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells, MSCs)、上皮細胞、脂肪細胞等。間充質(zhì)干細胞較其他種類細胞能夠分泌更多的外泌體[4]。研究[5]表明人間充質(zhì)干細胞(human mesenchymal stem cells, hMSCs)來源的外泌體能夠模擬MSCs的生物學功能，這提示外泌體可能是MSCs發(fā)揮生物學功能的重要方式。該研究從人骨髓間充質(zhì)干細胞中提取外泌體，觀察其對單核細胞增殖和分泌炎性因子的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

1.1.1主要試劑 α-MEM 培養(yǎng)基、青霉素、鏈霉素、胎牛血清、PBS(美國Gibco公司)；谷氨酰胺、TRIzol Reagent(美國Invitrogen公司)；I型膠原酶、胰蛋白酶、LPS、MTT(美國Sigma公司)；酶聯(lián)免疫吸附劑測定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒(美國R&D Systems公司)；人單核細胞分離液(天津灝洋生物制品科技有限公司)；二甲基亞砜(DMSO)(西安化學試劑廠)；Bradford蛋白濃度測定試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；ECL發(fā)光試劑盒(美國Pierce公司)。

1.1.2主要儀器 酶聯(lián)免疫檢測儀(型號：ELX800，美國BioTek公司)；倒置相差顯微鏡(型號：TS100，日本尼康株式會社)；掃描電鏡(型號：S-4800，日本日立公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1hMSCs的分離和培養(yǎng) 選取5例骨折需手術(shù)的患者，術(shù)前排除骨質(zhì)疏松癥和其他系統(tǒng)性疾病，術(shù)中用注射器抽取骨髓5 ml，并置于抗凝管中。將抽取的骨髓與等量的無血清α-MEM培養(yǎng)液混合均勻，4 ℃、400 r/min離心10 min；吸棄上清液，用培養(yǎng)液重懸細胞，并將其緩慢加入置有等體積Percoll分離液的離心管內(nèi)，使稀釋血液位于上層，Percoll分離液位于下層，注意保持液體分界面完整；4 ℃、400 r/min離心30 min，吸取中間的細胞層，PBS洗滌2次，用含胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)液重懸細胞；調(diào)整細胞密度為1×106/L，接種于培養(yǎng)瓶中。待細胞生長至80%～90%融合時，用胰蛋白酶消化、傳代。本實驗經(jīng)東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院倫理委員會批準，所有研究個體均征得患者知情同意。

1.2.2hMSCs來源的外泌體的提取和鑒定 取1 ml培養(yǎng)液以2 000 r/min離心30 min，吸取上清液，以2 ∶1比例加入外泌體提取試劑充分混勻，4 ℃ 過夜，10 000 r/min離心l h，吸棄上清液，用100 μl PBS重懸，即為外泌體。將20 μl 外泌體混勻后滴于銅網(wǎng)表面，室溫靜置1 min，濾紙吸干；磷鎢酸室溫復染5 min，濾紙吸干復染液，置于透射電子顯微鏡下觀察外泌體的大小和形態(tài)并照相。Western blot檢測CD63、CD81的表達。

1.2.3Ficoll-hypaque密度梯度離心法分離外周血單核細胞 取肝素抗凝全血與Hank′s液按1 ∶1比例混勻，輕輕加于2兩倍的Ficoll-hypaque分離液表面，以1 500 r/min離心20 min。離心后由上至下細胞分為4層，收集第2層白膜層細胞，放入含細胞洗滌液的試管中，充分混勻，1 500 r/min離心10 min，沉淀反復洗滌2次，即為單核細胞。用RPMI-1640培養(yǎng)液懸浮細胞，置于玻璃培養(yǎng)皿中，37 ℃孵育2 h，收集貼壁的單核細胞，調(diào)整細胞濃度至1×105/L備用。

1.2.4MTT檢測hMSCs來源的外泌體對單核細胞增殖的影響 將100 μl單核細胞懸液加入96孔板中，然后加入終濃度20 mg/L 的LPS用以刺激單核細胞增殖。將hMSCs來源的外泌體分別按照1、10、50、100 mg/L的終濃度加入孔中設(shè)為實驗組，未加入外泌體的孔設(shè)為對照組，另以100 μl PBS作為空白對照。每組均設(shè)3個復孔進行實驗。在第一天的孔中加入20 μl MTT液，37 ℃孵育4 h，PBS洗滌后加入150 μl DMSO，避光震蕩10 min后在酶聯(lián)免疫檢測儀490 nm波長下檢測吸光光度值。連續(xù)測量7 d。

1.2.5流式細胞儀檢測外泌體對單核細胞凋亡的影響 將100 mg/L 外泌體與單核細胞共培養(yǎng)3 d，將消化下來的細胞用PBS洗滌離心后，用2.5 ml帶血清培養(yǎng)基重懸細胞，流式上機檢測外泌體對單核細胞凋亡的影響。

1.2.6ELISA檢測單核細胞炎性因子的表達 將hMSCs來源的外泌體按照100 mg/L 的濃度加入含10%胎牛血清(去除外泌體)的α-MEM培養(yǎng)液設(shè)為實驗組，未加入外泌體的常規(guī)培養(yǎng)基設(shè)為對照組。在培養(yǎng)的單核細胞中加入終濃度20 mg/L LPS刺激炎性因子的分泌，24 h后收集細胞培養(yǎng)液。待測樣品中每孔各加入待測樣品100 μl，37 ℃孵育120 min。用洗滌液將反應板充分洗滌5次，向濾紙上印干。加入腫瘤壞死因子-α( tumor necrosis factor-α，TNF-α )、白介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、白介素-6(interleukin-6，IL-6)及白介素-8(interleukin-8，IL-8)第一抗體工作液50 μl，混勻后37 ℃ 孵育60 min，洗板；加入酶標抗體工作液100 μl，37 ℃孵育60 min，洗板；加入底物液100 μl，37 ℃避光反應10 min；加入50 μl終止液，混勻；在450 nm處檢測吸光值。

2 結(jié)果

2.1 hMSCs來源的外泌體的鑒定將提取到的外泌體溶于PBS，透射電鏡下觀察，外泌體為直徑介于40～150 nm之間、呈圓形或橢圓形的膜性小囊泡，囊泡外周可見其膜性結(jié)構(gòu)，中央為低電子密度成分(圖1A、1B)。Western blot結(jié)果顯示沉淀物CD63和CD81表達陽性，而對照組無CD63和CD81的表達(圖1C)。

圖1 外泌體的鑒定

2.2 外泌體對單核細胞增殖的影響在LPS的刺激下，單核細胞增殖增加，生長曲線呈典型的“S”型；而加入外泌體后單核細胞的增殖受到抑制。終濃度為1 mg/L 的外泌體對單核細胞增殖的抑制作用不明顯；終濃度為10、50和100 mg/L的外泌體均能抑制單核細胞的增殖，隨著濃度的增加，抑制作用明顯，顯示劑量依賴性，差異有統(tǒng)計學意義。見圖2。

圖2 MTT檢測梯度濃度外泌體對單核細胞增殖的影響

2.3 外泌體對單核細胞凋亡的影響hMSCs來源的外泌體具有促進單核細胞凋亡的作用，實驗組(圖3A)的早期凋亡率(B4：13.8%)、晚期凋亡率(B2：9.5%)以及總凋亡率(B2+B4：23.3%)均高于對照組(圖3B)。

圖3 流式細胞儀檢測外泌體對單核細胞凋亡的影響

2.4 外泌體對單核細胞分泌炎性因子的影響在LPS的刺激下，單核細胞會分泌炎性因子，其中TNF-α(89.89±9.59)mg/L、IL-1β(67.62±7.00)mg/L、IL-6(442.70±28.38)mg/L、IL-8(54.38±7.19)mg/L；而加入終濃度為100 mg/L 外泌體后TNF-α(26.65±5.44) mg/L(F=118.40,P<0.05)、IL-1β(35.53±4.71) mg/L(F=51.67,P<0.05)、IL-6(185.25±10.10) mg/L;(F=403.31,P<0.05)、 IL-8(45.36±5.67) mg/L(F=68.06,P<0.05)。結(jié)果顯示hMSCs來源的外泌體可以降低外周血單核細胞分泌炎性因子。見圖4。

圖4 ELISA檢測外泌體對單核細胞分泌炎性因子的影響

3 討論

早期的研究認為，外源性MSCs是通過歸巢、分化，從而修復損傷組織。但在實驗中觀察到，移植的MSCs大部分都停留在肝、脾、肺，到達損傷部位的MSCs不足1 %，而參與再生的細胞主要來源于模型中的固有細胞[6]。MSCs 的條件培養(yǎng)基同樣具有MSCs 的再生修復能力[5]。由此推測，外源性MSCs的組織再生作用可能不是因其分化能力，而是通過旁分泌的方式來實現(xiàn)的。隨后這些起修復作用的因子被證實為MSCs分泌的外泌體[7]。外泌體是一類直徑30～150 nm、密度為1.13～1.19 g/ml的膜性脂質(zhì)小囊泡，其內(nèi)含有功能性蛋白質(zhì)、mRNA及microRNA等物質(zhì)，可通過多種信號通路，影響細胞的生物學行為，參與組織的再生修復[8]。多種細胞均可以分泌外泌體，其中MSCs 是分泌外泌體能力最強的細胞之一[9]。

現(xiàn)已明確，hMSCs具有免疫調(diào)節(jié)的功能，可抑制T淋巴細胞、B淋巴細胞、NK-T細胞等的增殖，這種免疫調(diào)節(jié)能力可通過細胞直接接觸或旁分泌免疫調(diào)節(jié)因子，如TGF-β1、PGE2、IL-10等來實現(xiàn)。近年來的研究發(fā)現(xiàn)MSCs通過分泌外泌體參與多種細胞間的信息交流，可以保護急性腎小管損傷、促進神經(jīng)再生、減少心肌損傷的范圍[10-11]等，這可能是MSCs發(fā)揮治療功能的重要機制之一。因此，本實驗初步探索hMSCs來源的外泌體是否具有免疫調(diào)節(jié)功能。

本實驗采用外泌體試劑盒成功提取了MSCs來源的外泌體，進行了形態(tài)學的觀察，透射電鏡觀察下，hMSCs來源的外泌體為圓形或橢圓形的膜性小囊泡，大小不一，直徑在40～100 nm，腔內(nèi)呈現(xiàn)低密度；Western blot結(jié)果顯示hMSCs來源的外泌體 CD63和CD81表達陽性，與其來源細胞表達一致。本實驗采用MTT法檢測，在hMSCs來源的外泌體與經(jīng)LPS刺激的單核細胞共培養(yǎng)體系中，外泌體對單核細胞增殖的影響，實驗結(jié)果證實hMSCs來源的外泌體能抑制單核細胞的增殖；同時，流式細胞儀檢測結(jié)果表明，hMSCs來源的外泌體能促進單核細胞的凋亡。Taganov et al[12]用LPS刺激人單核細胞，運用miRNA基因芯片技術(shù)，發(fā)現(xiàn)miR-146a、miR-155和miR-132的表達增高。熊旭明 等[13]采用LPS誘導人單核細胞株THP-1，模擬免疫細胞炎癥反應過程，并通過細胞轉(zhuǎn)染的方法上調(diào)或下調(diào)細胞內(nèi)miR-29a的表達水平，結(jié)果顯示miR-29a能通過靶向作用于兩個抗凋亡基因Bcl-2和Mcl-1調(diào)控THP-1細胞凋亡水平。Pauley et al[14]通過轉(zhuǎn)染上調(diào)人單核細胞株THP-1細胞中的miR-146a，可以促進由LPS誘導的細胞凋亡。這些都提示外泌體可能通過miRNA調(diào)控單核細胞的凋亡過程。

為了進一步探明hMSCs來源的外泌體對單核細胞免疫調(diào)節(jié)功能的影響，本實驗采用ELISA法檢測外泌體與單核細胞共培養(yǎng)3 d后上清液中細胞因子的表達水平，結(jié)果顯示hMSCs來源的外泌體能夠抑制LPS刺激下單核細胞產(chǎn)生TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8，提示hMSCs來源的外泌體有望在炎癥、自身免疫性疾病治療中發(fā)揮治療作用。但其免疫調(diào)節(jié)作用的具體機制還有待進一步研究。