李曉梅, 宋金艷, 陳 芳, 徐 林, 李天禹, 羅 清

乳腺癌是全球女性癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一[1]?；熤委熑橄侔┠軌蛴行p少患者復(fù)發(fā)率與死亡率，但長(zhǎng)期應(yīng)用易產(chǎn)生多藥耐性(multidrug resistance，MDR)[2]。克服化療藥物耐藥性是治療乳腺癌需解決的難點(diǎn)與關(guān)鍵。針對(duì)這一難題，研究人員從多個(gè)角度進(jìn)行了有益探索，其中，從天然藥物中尋找高效、低毒、作用靶點(diǎn)廣泛的腫瘤 MDR 逆轉(zhuǎn)劑己成為目前臨床研究的重點(diǎn)[3]。

傳統(tǒng)中醫(yī)藥具有安全、價(jià)廉、毒副作用小等優(yōu)點(diǎn)。中醫(yī)或中西醫(yī)結(jié)合的治療手段貫穿乳腺癌治療的整個(gè)歷程，并且發(fā)現(xiàn)這些方法在逆轉(zhuǎn)腫瘤MDR方面作用不可忽視[4-5]。消乳散結(jié)湯是李天禹教授[6]根據(jù)多年臨床經(jīng)驗(yàn)結(jié)合貴州本地的中藥特點(diǎn)創(chuàng)制的經(jīng)驗(yàn)方，對(duì)乳腺癌輔助治療具有很好的療效。通過(guò)查閱相關(guān)文獻(xiàn)，該研究篩選出消乳散結(jié)湯方劑中具有抑制腫瘤生長(zhǎng)，但在逆轉(zhuǎn)乳腺癌MDR方面無(wú)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的有效單體，分別為熟地黃、白芍、梔子、半枝蓮以及浙貝母五味候選單藥。隨后，對(duì)五種候選單藥在逆轉(zhuǎn)乳腺癌MDR方面進(jìn)行了初步的探索，以期尋找具有MDR逆轉(zhuǎn)作用的藥物，為臨床治療MDR乳腺癌提供理論依據(jù)及新思路。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株與中藥本實(shí)驗(yàn)中使用的人乳腺癌細(xì)胞敏感株MCF-7由遵義醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院腫瘤研究室提供，人乳腺癌阿霉素耐藥細(xì)胞MCF-7/ADR購(gòu)于上海銀紫晶生物科技有限公司；MCF-7和MCF-7/ADR兩種細(xì)胞均用含10%胎牛血清的RPMI 1640完全培養(yǎng)基，于5% CO2、37 ℃條件下進(jìn)行培養(yǎng)。消乳散結(jié)湯中的五種單藥白芍、梔子、浙貝母、半枝蓮以及熟地黃均由遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院中藥局提供，并由遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院中醫(yī)科王剛老師進(jìn)行鑒定。各單藥均用常規(guī)水煎煮，經(jīng)過(guò)濾、超濾除去雜質(zhì)和細(xì)菌后，在無(wú)菌環(huán)境下將藥液濃縮制備成凍干粉，然后將其用PBS配制成1 mg/ml的貯存液備用。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器阿霉素(adriacin, ADR)(深圳萬(wàn)樂(lè)藥業(yè)有限公司)和MTT(美國(guó)Sigma-Aldrich公司)用PBS(pH =7.4)分別配制成1 mg/ml和5 mg/ml的貯存液。所有貯存液于0.22 μm濾器過(guò)濾除菌后，-20 ℃避光保存。胎牛血清(上海生工生物工程股份有限公司); RPMI 1640完全培養(yǎng)基(美國(guó)Hyclon公司); 倒置顯微鏡CKX41(日本OlymPus公司); 多功能酶標(biāo)儀318(上海三科儀器有限公司); CO2培養(yǎng)箱FormaTMⅡ3111(美國(guó)Thermo公司); 雙蒸水制備系統(tǒng)(美國(guó)MilliPore公司)。

1.3 ADR處理下MCF-7敏感株IC50的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)設(shè)置空白組、親本組和不同濃度ADR組(1、2、4、8、16、32 μg/ml)。第1天取增殖旺盛的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MCF-7細(xì)胞，用0.25%的胰酶消化后輕輕吹打制備成單細(xì)胞懸液。親本組和ADR組以每孔100 μl體積、5×103個(gè)細(xì)胞密度接種于96孔板，37 ℃、5% CO2，飽和濕度培養(yǎng)過(guò)夜。第2天吸棄兩組舊培養(yǎng)基，新增空白組，并在空白組和親本組中每孔加入100 μl新的RPMI 1640完全培養(yǎng)基，ADR組則每孔加入100 μl稀釋到相應(yīng)濃度ADR的RPMI 1640完全培養(yǎng)基。3組均繼續(xù)培養(yǎng)48 h后每孔加入20 μl MTT貯存液，再培養(yǎng)4 h后棄上清液,每孔加入150 μl二甲基亞砜(DMSO),避光振蕩10 min,酶標(biāo)儀檢測(cè)492 nm波長(zhǎng)處吸光值(OD值)。采用以下公式計(jì)算：ADR對(duì)MCF-7細(xì)胞的抑制率，并計(jì)算IC50值：細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率(%)=(親本組OD值-實(shí)驗(yàn)組OD值)/(親本組OD值-空白組OD值)×100%。

1.4 ADR處理下MCF-7/ADR細(xì)胞IC50的檢測(cè)與耐藥倍數(shù)的計(jì)算實(shí)驗(yàn)設(shè)置空白組、親本組、ADR組(6.25、12.5、25、50、100、200 μg/ml)，每組6個(gè)復(fù)孔。同樣采用MTT增殖實(shí)驗(yàn)法檢測(cè)并計(jì)算MCF-7/ADR細(xì)胞的IC50值，具體方法參照1.3。采用以下公式計(jì)算MCF-7/ADR耐藥倍數(shù)：細(xì)胞耐藥倍數(shù)=耐藥細(xì)胞株IC50/敏感細(xì)胞株IC50。

1.5 消乳散結(jié)湯各候選單藥對(duì)MCF-7/ADR細(xì)胞無(wú)毒劑量的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)設(shè)置空白組、親本組、候選單藥組(0.001%、0.01%、0.1%、1%、10%貯存液濃度)，每組6個(gè)復(fù)孔。實(shí)驗(yàn)方法同1.3，計(jì)算各候選單藥對(duì)MCF-7/ADR細(xì)胞IC10。

1.6 無(wú)毒劑量下對(duì)各候選單藥逆轉(zhuǎn)MCF-7/ADR細(xì)胞耐藥作用檢測(cè)實(shí)驗(yàn)分為空白組、ADR單獨(dú)處理組、單藥(濃度依據(jù)1.5項(xiàng)所測(cè)IC10選取 )+ADR組(6.25、12.5、25、50、100、200 μg/ml)。測(cè)量各候選單藥聯(lián)合不同濃度ADR組處理下MCF-7/ADR細(xì)胞IC50，按照以下公式分別計(jì)算逆轉(zhuǎn)倍數(shù)及逆轉(zhuǎn)率。逆轉(zhuǎn)倍數(shù)=ADR單獨(dú)處理組IC50/(ADR+單藥聯(lián)合處理組)IC50；逆轉(zhuǎn)率=[ADR單獨(dú)處理組IC50-(ADR+單藥聯(lián)合處理組)IC50]/ADR單獨(dú)處理組IC50×100%。上述每組實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 MCF-7細(xì)胞和MCF-7/ADR細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察MCF-7與MCF-7/ADR細(xì)胞均采用含10%胎牛血清的RPMI 1640完全培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。MCF-7細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，邊界清楚，呈多邊形，如圖1A所示。MCF-7/ADR細(xì)胞呈貼壁生長(zhǎng)狀態(tài)，邊界較MCF-7細(xì)胞模糊，如圖1B所示。

2.2 MCF-7/ADR細(xì)胞耐藥倍數(shù)的檢測(cè)以4 μg/ml ADR處理MCF-7細(xì)胞48 h后，MCF-7細(xì)胞狀態(tài)明顯變差，細(xì)胞由多邊形變?yōu)閳A形，大量細(xì)胞從貼壁狀態(tài)變?yōu)榉琴N壁狀態(tài)，漂浮于培養(yǎng)基中，如圖1C所示；以40 μg/ml ADR作用于MCF-7/ADR細(xì)胞48 h后，MCF-7/ADR細(xì)胞形態(tài)稍變化，體積較未加ADR的親本細(xì)胞稍變小，如圖1D所示。

圖1 ADR作用前后MCF-7與MCF-7/ADR細(xì)胞形態(tài) ×100

利用MTT增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同濃度ADR對(duì)兩種細(xì)胞存活率的影響，繪制出相應(yīng)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率曲線。結(jié)果如圖2所示，隨著ADR濃度的增高，MCF-7和MCF-7/ADR細(xì)胞的生長(zhǎng)受到明顯抑制，當(dāng)ADR濃度達(dá)到一定劑量時(shí)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制趨勢(shì)逐漸趨于平緩。根據(jù)相應(yīng)公式計(jì)算出MCF-7細(xì)胞的IC50為(2.88±0.31) μg/ml，MCF-7/ADR細(xì)胞的IC50為(115.05±2.45) μg/ml，耐藥倍數(shù)為47倍。

2.3 消乳散結(jié)湯中各候選單藥對(duì)MCF-7/ADR無(wú)毒劑量測(cè)定各候選單藥在0.001%～10%濃度范圍內(nèi)對(duì)MCF-7/ADR細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，結(jié)果如表1所示，在0.001%～1%濃度下，消乳散結(jié)湯單藥梔子、白芍、半枝蓮、熟地黃、浙貝母對(duì)MCF-7/ADR細(xì)胞抑制率在±0.5%之間，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)無(wú)明顯影響，不具有毒害作用。因此，選取對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性的低劑量(1 μg/ml)和高劑量(10 μg/ml)兩個(gè)濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖2 不同濃度ADR對(duì)MCF-7和MCF-7/ADR細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用

2.4 消乳散結(jié)湯中各候選單藥對(duì)MCF-7/ADR細(xì)胞耐藥逆轉(zhuǎn)作用的檢測(cè)與ADR單獨(dú)作用的標(biāo)準(zhǔn)組相比，單藥浙貝母聯(lián)合ADR作用于MCF-7/ADR細(xì)胞，其ADR的IC50工作濃度明顯下降，在無(wú)毒劑量下選擇的中藥低劑量組與高劑量組耐藥逆轉(zhuǎn)倍數(shù)分別為1.16與1.23，逆轉(zhuǎn)率分別為13.71%、18.77%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明在選取的無(wú)毒劑量作用下，浙貝母與ADR聯(lián)用時(shí)，對(duì)耐藥株MCF7/ADR具有明顯的耐藥逆轉(zhuǎn)作用。

表1 各候選單藥對(duì)MCF-7/ADR細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率(%)

而消乳散結(jié)湯中其他四味單藥白芍、梔子、熟地黃、半枝蓮，經(jīng)聯(lián)合ADR后作用于MCF-7/ADR細(xì)胞，與ADR單獨(dú)作用相比，耐藥的逆轉(zhuǎn)倍數(shù)和逆轉(zhuǎn)率相近，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，表明在選取的無(wú)毒劑量作用下，這幾位中藥與ADR的聯(lián)用，對(duì)耐藥株MCF7/ADR不具有耐藥逆轉(zhuǎn)作用，見(jiàn)表2、圖3。

圖3 高低劑量浙貝母聯(lián)合不同濃度ADR對(duì)MCF-7/ADR細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率

表2 單藥聯(lián)合ADR作用于MCF-7/ADR細(xì)胞的

3 討論

盡管乳腺癌治療取得了長(zhǎng)足的進(jìn)步，但乳腺癌患者的死亡率卻呈逐年上升趨勢(shì)，MDR是其主要原因之一。因此，逆轉(zhuǎn)乳腺癌細(xì)胞MDR是治療乳腺癌的新方向、新熱點(diǎn)，也是目前所面臨的最大挑戰(zhàn)。ADR作為化療的一線用藥，已廣泛應(yīng)用于各種化療方案治療乳腺癌，但長(zhǎng)期應(yīng)用可能增加耐藥性，導(dǎo)致治療失敗[7]。越來(lái)越多的研究表明，生物活性天然產(chǎn)物可作為化療增敏劑，在逆轉(zhuǎn)MDR方面具有療效，Zhou et al[8]研究認(rèn)為，苦參堿可通過(guò)PI3K / AKT信號(hào)通路逆轉(zhuǎn)乳腺癌MCF-7 / ADR細(xì)胞的MDR。因此，中醫(yī)藥耐藥逆轉(zhuǎn)劑具有開(kāi)發(fā)潛力和研究?jī)r(jià)值，并有可能成為新型抗癌劑。在本研究中，消乳散結(jié)湯是根據(jù)遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院李天禹教授多年治療乳腺癌臨床經(jīng)驗(yàn)總結(jié)得出的經(jīng)驗(yàn)方，對(duì)乳腺癌患者的治療具有一定療效，故本實(shí)驗(yàn)主要對(duì)此經(jīng)驗(yàn)方進(jìn)行單藥分析，來(lái)研究消乳散結(jié)湯中梔子、白芍、半枝蓮、熟地黃以及浙貝母五種單藥對(duì)乳腺癌MCF-7 / ADR細(xì)胞耐藥逆轉(zhuǎn)方面作用，以期發(fā)現(xiàn)具有耐藥逆轉(zhuǎn)作用的單藥為乳腺癌耐藥治療提供方向。

熟地黃[9]、白芍[10]、梔子[11]、半枝蓮[12]以及浙貝母[13]都有抗癌藥理活性。培米寧(PMI)是從浙貝母中提取的一種具有生物活性的成分。Tang et al[14]認(rèn)為，與ADR組相比，PMI聯(lián)合ADR可通過(guò)抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來(lái)提高胃癌化療中對(duì)ADR的藥物敏感性。為探討熟地黃、白芍、梔子、半枝蓮以及浙貝母四種單藥對(duì)MCF-7/ADR細(xì)胞的耐藥性影響，本研究選取各單藥對(duì)MCF-7/ADR細(xì)胞的無(wú)毒劑量，比較四種單藥分別聯(lián)合ADR干預(yù)MCF-7/ADR細(xì)胞與ADR單獨(dú)干預(yù)MCF-7/ADR細(xì)胞情況。結(jié)果顯示，與ADR單獨(dú)作用相比，單藥熟地黃、白芍、梔子和半枝蓮分別聯(lián)合ADR干預(yù)MCF-7/ADR細(xì)胞的IC50，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。然而，單藥浙貝母聯(lián)合ADR干預(yù)MCF-7/ADR細(xì)胞，細(xì)胞生長(zhǎng)明顯受限，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明浙貝母可增強(qiáng)MCF-7/ADR細(xì)胞對(duì)ADR的敏感性，具有MDR逆轉(zhuǎn)作用。此結(jié)果與Tang et al[14]研究結(jié)果具有一致性。進(jìn)一步研究結(jié)果顯示，在一定范圍內(nèi)浙貝母聯(lián)合高劑量ADR組更能促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞凋亡，說(shuō)明了其耐藥逆轉(zhuǎn)能力具有劑量相關(guān)性。本課題組將在此研究的基礎(chǔ)上，繼續(xù)深入研究浙貝母對(duì)耐藥逆轉(zhuǎn)的作用以及相關(guān)機(jī)制，為乳腺癌耐藥患者的治療提供新的思路。