甘 露，周弟彌， 張 磊， 陳 琳

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是繼阿爾茨海默病之后常見的與年齡相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病。PD在神經(jīng)病理學(xué)上的特征是多巴胺能神經(jīng)元的逐漸死亡和紋狀體多巴胺含量降低[1]。然而，多巴胺能神經(jīng)元死亡的分子機(jī)制仍不清楚。有研究者提出了假設(shè)，神經(jīng)細(xì)胞死亡的主要原因是線粒體功能障礙和隨后的氧化應(yīng)激[2]。氧化應(yīng)激下會(huì)過度產(chǎn)生活性氧(reactive oxygen species，ROS)而導(dǎo)致脂質(zhì)和蛋白質(zhì)的過氧化、核酸的氧化及DNA的分解，進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞損傷。轉(zhuǎn)錄因子核因子紅系衍生的核因子相關(guān)因子2(nuclear factor-erythroid2 related factor 2，Nrf2)是調(diào)節(jié)細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)的關(guān)鍵蛋白。在非應(yīng)激條件下，Nrf2被細(xì)胞質(zhì)中的Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白-1(Kelch like ECH associated protein 1，Keap1)錨定，并被泛素-蛋白酶體途徑降解。一旦細(xì)胞受到氧化損傷，Nrf2就會(huì)從Keap1釋放并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，與抗氧化反應(yīng)元件(antioxidant response element，ARE)結(jié)合，激活抗氧化基因的轉(zhuǎn)錄，其中血紅素氧合酶-1(Heme oxygenase-1，HO-1)是關(guān)鍵的抗氧化酶。Nrf2/HO-1信號(hào)通路是細(xì)胞氧化應(yīng)激過程中的保護(hù)性分子機(jī)制[3]。硫氧還蛋白-1(thioredoxin-1，TRX-1)具有調(diào)節(jié)氧化還原、激活轉(zhuǎn)錄因子和防治PD[4]等多種生物學(xué)活性。在不同的抗氧化劑中，TRX與TRX還原酶和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH)共同構(gòu)成了一個(gè)系統(tǒng)，調(diào)節(jié)細(xì)胞的氧化還原狀態(tài)[5]。但TRX-1是否通過Nrf2/HO-1通路防治PD尚未明確。該研究探討了過氧化TRX-1對(duì)1-甲基-4-苯基-吡啶離子(1-methyl-4-phenyl-pyridine，MPP+)處理的PC12細(xì)胞的抗凋亡作用以及Nrf2/HO-1信號(hào)通路在這一過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 主要材料大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤PC12細(xì)胞(美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)，American type culture collection，ATCC)；胎牛血清(杭州四季青公司)；Lipofectamine2000脂質(zhì)體(美國(guó)Invitrogen公司)；活性氧試劑盒(北京索萊寶公司)；MTT試劑盒(上海碧云天公司)；Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(美國(guó)Sigma-Aldrich)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(大連寶生物公司)；電泳凝膠成像分析系統(tǒng)(美國(guó)BIO RAD公司)

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)分組PC12細(xì)胞培養(yǎng)在含5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，加入100 U/mL 青霉素和100 μg/ml鏈霉素以及2 mmol/L的L-谷氨酰胺，置于5% 濕度，5% CO2的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔2～3 d更換1次培養(yǎng)基，每周傳代2次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分為3組：對(duì)照組，空載組以及過表達(dá)組。對(duì)照組的PC12細(xì)胞經(jīng)500 μmol/L MPP+處理24 h，空載組的PC12模型細(xì)胞經(jīng)脂質(zhì)體Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)入pcDNA-EV空載體，過表達(dá)組的PC12模型細(xì)胞經(jīng)脂質(zhì)體Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)入pcDNA-hTRX-1過表達(dá)載體。

1.3 過表達(dá)TRX-1載體的制備及轉(zhuǎn)染在NCBI上選擇將其克隆連接至載體pcDNA上，形成pcDNA-hTRX-1載體質(zhì)粒，經(jīng)Lipofectamine 2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)入PC12模型細(xì)胞中。同時(shí)，將pcDNA-EV空載質(zhì)粒也轉(zhuǎn)染到PC12模型細(xì)胞中用作陰性對(duì)照組(EV組)。

1.4 定量即時(shí)聚合酶鏈鎖反應(yīng)(qRT-PCR)檢測(cè)TRX-1 mRNA的表達(dá)從PC12細(xì)胞中提取總RNA。根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的說(shuō)明書操作，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó)invitrogen公司)將每個(gè)樣本中的1 μg RNA逆轉(zhuǎn)錄到cDNA，并通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增目的片段。TRX-1特異性引物序列：正義引物5′-CGGAATT CATGGTGAAGCAGATCGAGAGC-3′，反義引物5′-CGGGATCCGATTAGACTA ATTCATTAATG-3′，β-actin引物序列：正向引物5′-ATGGGCCCACAGTCGAC-3′，反義引物5′-GGTAGGGGTATGGCGTGGG-3′。PCR反應(yīng)程序：95 ℃持續(xù)5 min；然后95 ℃持續(xù)40 s，58 ℃持續(xù)40 s，72 ℃持續(xù)1 min，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后在72 ℃延伸10 min。將擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離檢測(cè)。

1.5 MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞增殖將各組細(xì)胞置于96孔板上培養(yǎng)至5×104個(gè)/ml細(xì)胞密度，每孔加入10 μl 5 mg/ml 的MTT溶液，再在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱下培養(yǎng)4 h，然后小心去除培養(yǎng)基。加入100 μl DMSO溶液溶解被還原出的水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚，再用酶標(biāo)儀檢測(cè)每孔溶液在波長(zhǎng)490 nm處的OD值。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡及ROS水平取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的PC12細(xì)胞，按活性氧檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，利用熒光探針DCFH-DA測(cè)量細(xì)胞過氧化物水平，再用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)強(qiáng)綠色熒光物質(zhì)DCF的熒光信號(hào)值變化。將對(duì)數(shù)期的PC12細(xì)胞在4 ℃離心機(jī)中經(jīng)3 500 r/min離心5 min后，用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液洗滌3次，再用Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.7 Western blot檢測(cè)細(xì)胞相關(guān)蛋白的表達(dá)取對(duì)數(shù)期細(xì)胞，加入核蛋白裂解液后刮取蛋白，然后用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，再將蛋白置于沸水浴中變性10 min。制備合適濃度的SDS-PAGE膠，將提取出的蛋白上樣后電泳，再濕轉(zhuǎn)到PVDF膜上。用5%的牛奶封閉30 min后，加入一抗anti-Bcl-2、anti-Bax、anti-Cyt-c、anti-cleaved Caspase-3、anti-Nrf2、anti-HO-1、NAPDH，置于4 ℃孵育過夜。再加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育2 h后，加入ECL化學(xué)發(fā)光液曝光，最后使用Image J軟件分析膜上蛋白條帶的灰度值。

2 結(jié)果

2.1 TRX-1在3組PC12細(xì)胞中的表達(dá)通過qRT-PCR檢測(cè)3組PC12細(xì)胞中TRX-1 mRNA的表達(dá)水平，結(jié)果顯示與對(duì)照組(0.96±0.19)和空載組(1.03±0.42)比較，過表達(dá)組(4.32±0.61)的PC12細(xì)胞中TRX-1的mRNA水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=55.93，P<0.05)，該結(jié)果說(shuō)明成功構(gòu)建并轉(zhuǎn)染了過表達(dá)TRX-1質(zhì)粒。

2.2 過表達(dá)TRX-1對(duì)帕金森病PC12細(xì)胞增殖的影響通過MTT法檢測(cè)了PC12中過表達(dá)TRX-1對(duì)細(xì)胞增殖的作用。與對(duì)照組(48 h：157.32±15.64；72 h：215.93±9.78)和空載組(48 h：155.70±50.46；72 h：200.77±8.43)比較，過表達(dá)組(48 h：198.21±16.72；72 h：277.15±10.10)的PC12細(xì)胞增殖率升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(48 h：F=5.54，P<0.05；72 h：F=54.77，P<0.05)。見圖1。

圖1 MTT法檢測(cè)過表達(dá)TRX-1對(duì)帕金森病PC12細(xì)胞增殖的影響與過表達(dá)組比較：*P<0.05

2.3 過表達(dá)TRX-1對(duì)帕金森病PC12細(xì)胞凋亡的影響通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了過表達(dá)TRX-1對(duì)帕金森病PC12細(xì)胞凋亡的影響。與對(duì)照組(33.92±2.87)和空載組(32.75±1.85)比較，過表達(dá)組(10.23±2.03)的細(xì)胞凋亡率降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=101.72，P<0.05)。并且通過Western blot檢測(cè)了凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、Cyt-c及cleaved Caspase-3的表達(dá)水平(圖2)。與對(duì)照組(Bax/Bcl-2：2.94±0.21；Cyt-c：0.84±0.10；cleaved Caspase-3：0.64±0.072)和空載組(Bax/Bcl-2：2.72±0.31；Cyt-c：0.79±0.095；cleaved Caspase-3：0.59±0.065)比較，過表達(dá)組的Bax/Bcl-2比值(0.32±0.15)、Cyt-c(0.12±0.033)以及cleaved Caspase-3(0.097±0.023)蛋白的表達(dá)均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Bax/Bcl-2：F=116.82，P<0.05；Cyt-c：F=72.32，P<0.05；cleaved Caspase-3：F=81.57，P<0.05)。

2.4 過表達(dá)TRX-1對(duì)帕金森病PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)過表達(dá)TRX-1對(duì)帕金森病PC12細(xì)胞ROS的作用。與對(duì)照組(100.00±3.42)和空載組(97.25±5.30)比較，過表達(dá)組(38.33±4.78)的PC12細(xì)胞內(nèi)ROS含量下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=185.53，P<0.05)。并且通過Western blot檢測(cè)氧化應(yīng)激相關(guān)Nrf2/HO-1通路蛋白的表達(dá)(圖3)。與對(duì)照組(Nrf2：0.48±0.11；HO-1：0.88±0.33)與空載組(Nrf2：0.44±0.16；HO-1：0.91±0.28)比較，過表達(dá)組的細(xì)胞核Nrf2 (1.35±0.24)和HO-1(1.73±0.12)蛋白的表達(dá)水平上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Nrf2：F=24.97，P<0.05；HO-1：F=10.38，P<0.05)。

圖2 Western blot檢測(cè)過表達(dá)TRX-1對(duì)帕金森病PC12細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的影響與過表達(dá)組比較：*P<0.05

圖3 Western blot檢測(cè)過表達(dá)TRX-1對(duì)帕金森病PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激Nrf2/HO-1通路相關(guān)蛋白的影響與過表達(dá)組比較：*P<0.05

3 討論

迄今為止，PD已經(jīng)確定了幾種遺傳形式，PD導(dǎo)致顯性和隱性遺傳性PD，但環(huán)境因素也可能導(dǎo)致疾病風(fēng)險(xiǎn)。有證據(jù)表明氧化應(yīng)激參與了PD病理學(xué)的進(jìn)展[6]。在PD大腦中觀察到線粒體功能障礙和抗氧化能力下降，這些基礎(chǔ)特性普遍用于模擬PD疾病相關(guān)的動(dòng)物以及細(xì)胞實(shí)驗(yàn)[7]。臨床發(fā)現(xiàn)某些患者在意外遭到1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine，MPTP)中毒后，出現(xiàn)了帕金森病癥狀，隨后研究發(fā)現(xiàn)了1-甲基4-苯基吡啶(1-methyl-4-phenyl-pyridine，MPP+)是MPTP的代謝物，能進(jìn)入黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元中，抑制線粒體復(fù)合體和ATP的產(chǎn)生，最終導(dǎo)致多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞凋亡[8]。另外，大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤PC12細(xì)胞與原發(fā)性交感神經(jīng)細(xì)胞具有許多共同細(xì)胞培養(yǎng)特性，在科研中常被用來(lái)建立PD細(xì)胞模型[9]。本研究中采用了MPP+誘導(dǎo)PC12細(xì)胞產(chǎn)生PD相關(guān)表型。

Bcl-2蛋白家族是一個(gè)重要的細(xì)胞活性內(nèi)源性調(diào)節(jié)因子，參與線粒體凋亡途徑。Bcl-2家族由抗凋亡蛋白(如Bcl-2)和促凋亡蛋白(如Bax)組成。在細(xì)胞凋亡過程中，細(xì)胞色素c(Cyt-c)從線粒體膜轉(zhuǎn)移到胞質(zhì)中，在胞質(zhì)中激活Caspase-3(cleaved Caspase-3)，其中Caspase-3是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵蛋白。在本研究中，過表達(dá)TRX-1調(diào)節(jié)了Bcl-2家族蛋白的水平(下調(diào)Bax/Bcl-2比值)，抑制了MPP+誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞的Cyt-c釋放和cleaved Caspase-3的產(chǎn)生。說(shuō)明過表達(dá)TRX-1對(duì)MPP+誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞具有保護(hù)作用，能有效促進(jìn)MPP+誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞增殖，抑制凋亡。這與之前的研究[10]結(jié)果一致。線粒體參與細(xì)胞存活，并通過控制細(xì)胞能量代謝、ROS的產(chǎn)生和凋亡因子釋放到細(xì)胞質(zhì)中，在細(xì)胞凋亡中起著中心作用。先前的研究[11]表明，ROS參與了MPP+誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞毒性及其相關(guān)凋亡機(jī)制。因此本研究也探討了TRX-1與ROS在MPP+誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡中的關(guān)系。結(jié)果顯示，過表達(dá)TRX-1能降低MPP+誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡中的ROS含量。

ROS產(chǎn)生和抗氧化應(yīng)激防御系統(tǒng)之間的不平衡可能對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生高度有害的影響。Nrf2作為參與細(xì)胞抗氧化反應(yīng)的一種重要轉(zhuǎn)錄因子，與細(xì)胞中編碼解毒酶的基因HO-1中的抗氧化反應(yīng)元件結(jié)合。Nrf2是抗氧化酶的重要介質(zhì)，在細(xì)胞中提供了一種間接的方式來(lái)增強(qiáng)其抗氧化能力，從而防止細(xì)胞對(duì)自由基的反應(yīng)功能障礙。在非氧化條件下，Nrf2與Keap1結(jié)合，形成一個(gè)復(fù)合物，保留在細(xì)胞質(zhì)中。在氧化損傷后，Nrf2從Keap1-Nrf2復(fù)合物分離并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，結(jié)合并增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激的反應(yīng)[12]。在由Nrf2調(diào)控的靶基因中，HO-1參與抗氧化反應(yīng)。研究[13]表明，HO-1在抗氧化損傷的神經(jīng)保護(hù)功能中起著重要作用。此外，抗氧化酶HO-1的表達(dá)通過保護(hù)多巴胺能神經(jīng)元發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[14]。因此，為了確定Nrf2/HO-1信號(hào)通路是否參與過表達(dá)TRX-1的神經(jīng)保護(hù)作用，我們研究了過表達(dá)TRX-1處理的MPP+誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞中Nrf2/HO-1信號(hào)通路的變化。結(jié)果表明，在過表達(dá)TRX-1處理的MPP+誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞中，Nrf2與HO-1蛋白表達(dá)水平均上調(diào)。

綜上所述，本研究結(jié)果表明過表達(dá)TRX-1能通過激活Nrf2/HO-1信號(hào)通路抑制PD PC12細(xì)胞的凋亡，進(jìn)一步研究TRX-1可能成為治療PD的潛在治療靶點(diǎn)。