趙雅潔，季嘉玲，文先麗，李善文，張愛青，甘衛(wèi)華

慢性腎臟病(chronic kidney disease，CKD)患者數(shù)逐年增多，成為影響公共健康的重要問題，增加了全球的社會經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[1]。研究[2]表明我國成人慢性腎臟病的發(fā)生率高達(dá)10.8%。腎小管間質(zhì)炎癥是急慢性腎病中常見的病理表現(xiàn)，在多種外界因素刺激下，腎小管上皮細(xì)胞分泌炎癥因子及趨化因子，誘導(dǎo)腎間質(zhì)出現(xiàn)炎癥和纖維化改變 。此外，氧化應(yīng)激在腎損傷中也扮演了重要角色，由致炎因子引起的細(xì)胞的氧化應(yīng)激也是導(dǎo)致腎損傷的重要原因之一[3]。血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，AngⅡ)是腎內(nèi)腎素-血管緊張素-醛固酮(RAAS)系統(tǒng)中的重要活性物質(zhì)，對氧化應(yīng)激、纖維化、炎癥均有影響[4]。N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine，NAC)能促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)還原型谷胱甘肽(GSH)的合成，是活性氧(reactive oxygen species，ROS)抑制劑，具有清除氧自由基、抗氧化、抗凋亡及抗炎等作用，臨床上廣泛應(yīng)用于心臟、腎臟、肺部等多種疾病。該研究以HK-2細(xì)胞作為實驗研究對象，采用血管緊張素Ⅱ干預(yù)HK-2細(xì)胞模擬炎癥模型，N-乙酰半胱氨酸干預(yù)HK-2細(xì)胞，旨在探討N-乙酰半胱氨酸對AngⅡ誘導(dǎo)的人HK-2細(xì)胞炎癥相關(guān)因子的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑HK-2細(xì)胞株購于美國ATCC公司；胎牛血清、胰酶、DMEM/F12培養(yǎng)基等均購自美國Gibco公司；NAC、AngⅡ購自美國MCE(MedChemExpress)公司；TRIzol試劑、PCR檢測試劑盒由日本Takara公司提供;PCR引物由上海銳捷生物公司合成；BCA試劑盒購自中國凱基生物；鼠抗人GAPDH多克隆抗體購于上海Abway公司；腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)、白介素1β(interleukin-1β，IL-1β)抗體購自美國Abcam公司；單核細(xì)胞趨化蛋白1(monocyte chemotactic protein 1，MCP-1)抗體購自美國santa公司；PVDF膜和顯影液購于美國millipore公司；HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗購自Proteintech公司。

1.2 方法

1.2.1實驗分組 將HK-2細(xì)胞株用含10% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中。待培養(yǎng)基中細(xì)胞生長至70%～80%時，用1 ml胰酶消化后進(jìn)行傳代培養(yǎng)。實驗分組為：空白對照組、AngⅡ組、NAC組、AngⅡ+NAC組。干預(yù)時間為48 h。

1.2.2RT-PCR技術(shù)檢測TNF-α、IL-6水平 細(xì)胞按組種板干預(yù)48 h后，將1 ml TRIzol試劑加入6孔板內(nèi)，提取細(xì)胞總RNA，20 μl DEPC水溶解，用Nanodrop分光光度計檢測濃度,根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作合成cDNA，取適量產(chǎn)物配置10 μl PCR反應(yīng)體系，用thermo fisher 7300，實時熒光定量PCR儀進(jìn)行檢測。以GAPDH為內(nèi)參，檢測TNF-α、IL-6 mRNA表達(dá)。以2-ΔΔCT法計算相對表達(dá)量。引物序列如下：① TNF-α引物序列：F: 5′-CATCTTCTCAAA ATTCGAGTGACAA-3′,R: 5′-TGGGAGTAGACAAG GTACAACCC-3′；② IL-6引物序列：F: 5′-AAAGA GTTGTGCAATGGCAATTCT-3′, R:5′-AAGTGCATCA TCGTTGTTCATACA-3′；③ GAPDH引物序列：F:5′-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3′,R:5′-AGGGGCCAT AACAAGTCTTC-3′。

1.2.3Western blot檢測HK2細(xì)胞TNF-α、MCP-1、IL-1β蛋白表達(dá)量 依照分組用NAC(5 mmol/L)、AngⅡ(1 mmol/L)干預(yù)HK2細(xì)胞48 h后，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，按100 ∶1 ∶1的比例加入RIPA、PMSF和蛋白酶抑制劑(100 μl+1 μl+1 μl)，細(xì)胞刮刮下細(xì)胞并于冰上裂解1 h，集于EP管中，4 ℃、12 000 r/min離心30 min后取上清液，BCA法檢測蛋白濃度，稀釋至最小濃度，并按1/4 體積加入5×上樣緩沖液，100 ℃金屬加熱器中變性5 min。用12%的SDS-PAGE凝膠電泳的方法分離蛋白質(zhì)，電泳后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，室溫下5%BSA封閉1 h，加一抗(稀釋比例1 ∶1 000)于室溫孵育30 min,再4 ℃孵育過夜。次日室溫下復(fù)溫30 min后用1×TBST洗膜3次后，加二抗(1 ∶2 000)，室溫孵育1 h。1× TBST洗膜3次，加顯影液后用天能凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行圖像的掃描及記錄。

1.2.4免疫熒光法檢測TNF-α的表達(dá)分布情況 將細(xì)胞(3.0×106/孔)接種至6孔板，待細(xì)胞生長至80%時按照試驗分組給予不同藥物作用48 h。待藥物作用后， PBS洗3次，然后加入4%多聚甲醛固定液15 min靜置，PBS再洗3次，0.25% Triton X-100破膜30 min，隨后室溫封閉1 h，再以稀釋的一抗(1 ∶200)于4 ℃孵育過夜，次日PBS洗3次，加DIPA染核，避光靜置5 min，PBS洗滌后甘油封片，熒光顯微鏡鏡下觀察，將圖片保存。

2 結(jié)果

2.1 NAC、AngⅡ作用HK2細(xì)胞后TNF-α和IL-6 mRNA的相對表達(dá)量依照分組用NAC(5 mmol/L)、AngⅡ(1 mmol/L)干預(yù)HK2細(xì)胞48 h后，提取細(xì)胞中的RNA，RT-PCR法檢測HK2細(xì)胞中TNF-α、IL-6的mRNA表達(dá)水平(圖1)。對照組、AngⅡ組、NAC組、AngⅡ+NAC組炎癥相關(guān)因子TNF-α、IL-6的mRNA表達(dá)水平的總體比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F=31.56，P<0.01；F=17.59，P<0.01)，其中AngⅡ組TNF-α、IL-6表達(dá)上調(diào)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01,P<0.05),NAC+AngⅡ組TNF-α、IL-6 mRNA表達(dá)量下調(diào)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.000 1,P<0.001)。

圖1 NAC、AngⅡ?qū)K2細(xì)胞TNF-α、IL-6 mRNA的相對表達(dá)量

2.2 NAC、AngⅡ作用HK2細(xì)胞后IL-1β、TNF-α和MCP-1蛋白表達(dá)量依照分組用NAC(5 mmol/L)、AngⅡ(1 mmol/L)干預(yù)HK2細(xì)胞48 h后，提取細(xì)胞質(zhì)中的蛋白，Western blot檢測HK2細(xì)胞中IL-1β、TNF-α和MCP-1的表達(dá)水平改變(圖2)。對照組、AngⅡ組、NAC組、AngⅡ+NAC組炎癥相關(guān)因子IL-1β、TNF-α、MCP-1的蛋白表達(dá)水平的總體比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F=38.21，P<0.01；F=63.54，P<0.01；F=170.4,P<0.01);與對照組比較，AngⅡ處理組纖維化相關(guān)蛋白IL-1β、MCP-1和TNF-α蛋白表達(dá)量上調(diào)，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.000 1)，提示AngⅡ能夠誘導(dǎo)HK2細(xì)胞炎癥相關(guān)因子表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)炎癥作用；與AngⅡ組相比，NAC+AngⅡ組能夠下調(diào)IL-1β、TNF-α、MCP-1蛋白表達(dá)量，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.000 1)。提示NAC能夠抑制AngⅡ誘導(dǎo)HK2細(xì)胞炎癥相關(guān)因子表達(dá)的增加；NAC組與對照組相比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

圖2 NAC、AngⅡ?qū)K2細(xì)胞IL-1β,TNF-α,MCP-1蛋白表達(dá)量

2.3 NAC和AngⅡ作用HK2細(xì)胞后TNF-α表達(dá)情況熒光顯微鏡觀察上述分組各細(xì)胞中的TNF-α熒光表達(dá)分布情況，在胞質(zhì)中TNF-α呈綠色熒光，所有細(xì)胞核成藍(lán)色熒光。在對照組、NAC組細(xì)胞中未見TNF-α熒光信號，AngⅡ組TNF-α呈綠色熒光，而在NAC+AngⅡ組中，TNF-α的綠色熒光信號降低(圖3)。

3 討論

CKD是一類進(jìn)展性疾病，其病理過程包括腎臟炎癥、小管損傷、s血管病變和腎間質(zhì)纖維化[5]。CKD威脅了人們的健康，可能出現(xiàn)全身系統(tǒng)包括呼吸、消化、血液系統(tǒng)的損傷，也有研究[6-7]表明對肌肉骨骼肌系統(tǒng)產(chǎn)生損傷。研究[8]表明腎小管間質(zhì)炎癥病變在CKD腎功能損傷中發(fā)揮重要作用。且現(xiàn)有研究[9]表明腎小管損傷早于腎小球損傷。如何保護(hù)腎小管損傷，是今后研究慢性腎臟病的預(yù)防和治療中的關(guān)鍵內(nèi)容。

圖3 各組HK2細(xì)胞內(nèi)TNF-α免疫熒光表達(dá) ×400

RAAS的過度激活在CKD中顯著存在。AngⅡ是RAAS系統(tǒng)中的主要活性物質(zhì)，對氧化應(yīng)激、纖維化、炎癥均有影響[4]。AngⅡ不僅能直接激活炎癥細(xì)胞，也能誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞合成分泌TNF-α、IL-6和MCP-1等炎癥相關(guān)因子[10]，促進(jìn)炎癥性疾病的發(fā)生發(fā)展。除此以外，AngⅡ能激活NADH氧化酶，促進(jìn)ROS生成，導(dǎo)致氧化應(yīng)激反應(yīng)[11]。活性氧的產(chǎn)生又能夠引起轉(zhuǎn)錄因子AP-1和NF-κB的激活，從而促進(jìn)腎臟聚集炎性細(xì)胞，促進(jìn)炎癥的發(fā)生[12]?？梢夾ngⅡ可能通過刺激活性氧及過氧化物的形成來介導(dǎo)NF-KB活化，促進(jìn)了炎癥。目前有研究[13]表明AngⅡ通過與AT1和AT2受體的結(jié)合來激活NF-κB通路,進(jìn)而直接激活炎癥細(xì)胞，或間接通過炎癥相關(guān)因子，誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞遷移。

NAC是半胱氨酸的前體，結(jié)構(gòu)式中包含硫基，可促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)GSH的合成，干擾氧自由基的生成，清除已經(jīng)生成的氧自由基，從而發(fā)揮抗氧化應(yīng)激的作用。目前NAC在腎臟病的應(yīng)用方面主要集中在造影劑腎病方面，有研究[14]顯示在糖尿病腎病方面,NAC對非肥胖型糖尿病大鼠中一型糖尿病的發(fā)生有預(yù)防作用，其機(jī)制可能與抑制氧化應(yīng)激有關(guān)。用抗氧化劑NAC預(yù)孵育的細(xì)胞強(qiáng)烈抑制了在過氧化氫及IL-1β刺激誘導(dǎo)下的IL-8和MCP-1水平，表明NAC等抗氧化劑在改善腎缺血再灌注損傷可發(fā)揮作用[15]。

本實驗中，AngⅡ干預(yù)組的炎癥相關(guān)因子表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)了炎癥，提示炎癥模型建立成功，NAC組與對照組相比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，提示本研究中NAC不會誘導(dǎo)炎癥相關(guān)因子產(chǎn)生，NAC+AngⅡ干預(yù)組炎癥相關(guān)因子表達(dá)下調(diào)，表明NAC對AngⅡ誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞的炎癥有抑制作用，可保護(hù)腎小管上皮細(xì)胞，本實驗尚未對其中的機(jī)制進(jìn)行研究，NAC能抑制炎癥相關(guān)的作用機(jī)制尚不明確，有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，NAC能夠抑制AngⅡ誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞中炎癥相關(guān)因子的表達(dá)，筆者猜想氧化應(yīng)激是其作用的關(guān)鍵，該作用可抑制活性氧的產(chǎn)生，減輕腎臟組織中炎癥相關(guān)因子的累積，從而減輕炎癥反應(yīng)。本研究通過建立AngⅡ誘導(dǎo)的hk-2細(xì)胞的炎癥模型，明確了NAC具有抑制AngⅡ誘導(dǎo)炎癥相關(guān)因子產(chǎn)生的作用，為其提供了實驗依據(jù)。