秦新新，邱 競，呂雪蓮，李 佳，劉 宇，白義鳳

肺癌(lung cancer，LC)是最常見的惡性腫瘤之一，也是全球最致命的癌癥，約占所有癌癥死亡人數(shù)的25%[1]。而非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)約占LC病例的85%，且在診斷時，大約75%的患者處于中晚期，五年生存率非常低[2]。盡管近年來在肺癌領(lǐng)域中研發(fā)了新藥和新療法，但是仍然存在生存率低和副作用強等缺陷。因此，急需探索新的分子靶標(biāo)來改善NSCLC的治療。miR-17是常見抑癌基因之一，在前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌等多種癌癥中低表達(dá)，可通過調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡和侵襲抑制癌癥的發(fā)展[3]。miR-17在NSCLC中低表達(dá)[4]，miR-17-5p下調(diào)導(dǎo)致NSCLC細(xì)胞對厄洛替尼耐藥[5]。但miR-17對NSCLC的作用和機制尚不清楚。miRNA可通過調(diào)節(jié)脂肪酸代謝改變NSCLC細(xì)胞生長，如miR-21[6]。該研究探討miR-17通過調(diào)節(jié)脂肪酸代謝對NSCLC作用及機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑DMEM培養(yǎng)液(杭州吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司，貨號：CNM-12851)；胎牛血清(上海素爾生物科技有限公司，貨號：16000-044)；青霉素和鏈霉素雙抗溶液(上海素爾生物科技有限公司，貨號：15140122)；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑(上海恪敏生物科技有限公司，貨號：11668-027)；miR-17 mimic 質(zhì)粒、mimic-NG質(zhì)粒、pc-CD36質(zhì)粒、pc-SCD質(zhì)粒及各種引物由上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計并合成；磷脂測定試劑盒(上海艾研生物科技有限公司，貨號：bs20193)；三酰甘油測定試劑盒(南京博全科技有限公司，貨號：E1013)；RIPA裂解緩沖液(南京海克爾生物科技有限公司，貨號：SBJ-0999)；BCA試劑盒(上海易色醫(yī)療科技有限公司，貨號：BC201)；分化簇36(cluster of differentiation 36，CD36)、脂肪酸合成酶(fatty acid synthase，F(xiàn)ASN)、乙酰輔酶a羧化酶(acetyl-CoA carboxylase，ACC1)、脂肪酸結(jié)合蛋白5(fatty acid binding protein 5，F(xiàn)ABP5)抗體(上海艾博抗生物科技有限公司，貨號：ab133625、ab22759、ab45174、ab37267)；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(北京原平皓生物技術(shù)有限公司，貨號：GN201-01)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)人NSCLC細(xì)胞系(H1703、A549、H1299、L78、PGCL3、H460)和正常肺細(xì)胞(BEAS-2B)購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心。用含有100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的10%牛血清的DMEM培養(yǎng)基，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染取對數(shù)期的A549細(xì)胞，接種于6孔板(1×106/孔)。當(dāng)達(dá)到80%融合，根據(jù)Lipofectamine 2000說明書將100 nmo/L 的miR-17 mimic 質(zhì)粒、mimic-NG質(zhì)粒、pc-CD36質(zhì)粒、pc-SCD質(zhì)粒分別或聯(lián)合轉(zhuǎn)染進入A549細(xì)胞。

1.4 RT-qPCR檢測miR-17 mRNA的表達(dá)采用QIAzol裂解試劑提取總RNA，采用cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。RT-qPCR采用SYBR-Green PCR試劑盒說明書操作進行。U6作為內(nèi)參，使用2-ΔΔCt方法計算。U6的上游引物序列：5′-CTCGCTTCGG CAGCACA-3′，下游引物序列：5′-AACGCTTCACG AATTTGCGT-3′；miR-17的上游引物序列為：5′-TGCGGCAAAGTGCTTACAGTG-3′，下游引物序列為：5′-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3′。

1.5 克隆形成實驗檢測細(xì)胞生長將各組A549細(xì)胞接種于96孔板,按照2×103個細(xì)胞/孔，直到生長至可見菌落。用甲醇固定菌落，0.25% 結(jié)晶紫染色30 min，計數(shù)菌落數(shù)量。

1.6 劃痕實驗檢測細(xì)胞遷移能力將各組A549細(xì)胞消化鋪滿單層,并用小號槍頭垂直劃痕，加入無血清培養(yǎng)基，在5% CO2、37 ℃恒溫的培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，分別在顯微鏡下拍照，用 Image J 軟件分析。

1.7 Transwell法檢測細(xì)胞侵襲能力在Transwell小室上室接種A549細(xì)胞懸浮液和不含血清的培養(yǎng)基，終濃度為 2.5×105個/ml，并在Transwell小室下室加入含血清和絲裂霉素C的培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h后，取出Transwell 小室，用結(jié)晶紫染色，并在顯微鏡下觀察分析，侵入細(xì)胞數(shù)表示為每視野的平均細(xì)胞數(shù)。

1.8 試劑盒檢測磷脂和三酰甘油含量根據(jù)磷脂測定試劑盒和三酰甘油測定試劑盒說明書，測定各組細(xì)胞中磷脂和三酰甘油的含量。

1.9 Western blot檢測CD36、FASN、ACC1、FABP5蛋白表達(dá)水平收集各組細(xì)胞，用RIPA裂解液提取總蛋白，并用BCA試劑盒檢測蛋白濃度，然后經(jīng) SDS-PAGE分離蛋白后，用半干轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)至PVDF膜，并用脫脂牛奶室溫封閉蛋白2 h，再加入兔來源的單克隆一抗(CD36 1 ∶1 000、FASN 1 ∶500、ACC1 1 ∶1 000、FABP5 1 ∶1 000)在4 ℃ 封閉過夜，接著加入對應(yīng)山羊抗兔二抗(1 ∶2 000)室溫封閉1 h，最后滴ECL曝光，以GAPDH為內(nèi)參，使用Quantity One軟件分析目標(biāo)蛋白的相對表達(dá)水平。

1.10 雙熒光素酶報告檢測靶向關(guān)系收集生長至對數(shù)期的A549細(xì)胞，鋪于96孔板，每孔約4×103個細(xì)胞，24 h后，分別轉(zhuǎn)染mimic-NC+SCD wt、mimic-NC+ SCD mut、miR-17 mimic+SCD wt、miR-17 mimic+SCD mut，根據(jù)雙熒光素酶報告基因試劑盒說明進行測定，用螢火蟲熒光素酶活性和腎熒光素酶活性比值表示熒光素酶的相對活性。

2 結(jié)果

2.1 miR-17在NSCLC中表達(dá)下調(diào)RT-qPCR結(jié)果顯示，不同細(xì)胞組間 miR-17 mRNA的表達(dá)水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=46.258，P=0.000)。與正常肺細(xì)胞BEAS-2B相比，NSCLC細(xì)胞系(H1703、A549、H1299、L78、PGCL3、H460)中miR-17 mRNA的表達(dá)下調(diào)(P<0.01)，并選擇A549細(xì)胞做后續(xù)實驗。見圖1。

圖1 RT-qPCR檢測miR-17 mRNA的表達(dá)與正常肺細(xì)胞BEAS-2B比較：**P<0.01

2.2 miR-17抑制NSCLC細(xì)胞A549的細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移克隆實驗結(jié)果顯示，對照組、mimic-NC組、miR-17 mimic組克隆細(xì)胞數(shù)目分別是(187.67±12.56)、(185.43±11.82)、(98.67±10.92)，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=672.344，P=0.000)。劃痕實驗結(jié)果顯示，對照組、mimic-NC組、miR-17 mimic組劃痕閉合率分別是(45.13±9.12)%、(44.52±8.76)%、(19.46±8.69)%，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=527.346，P=0.000)。Transwell結(jié)果顯示，對照組、mimic-NC組、miR-17 mimic組克隆細(xì)胞數(shù)目分別是(271.21±11.37)、(268.33±12.14)、(109.67±11.86)，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=976.552，P=0.000)。與對照組相比，mimic-NC組克隆細(xì)胞數(shù)目、劃痕閉合率、侵襲細(xì)胞數(shù)目均無變化(P>0.05)，miR-17 mimic組克隆細(xì)胞數(shù)目、劃痕閉合率、侵襲細(xì)胞數(shù)目均減少(P<0.01)。見圖2。

2.3 miR-17抑制NSCLC細(xì)胞中脂肪酸代謝各組間細(xì)胞磷脂和三酰甘油含量及FASN、ACC1、FABP5蛋白表達(dá)差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F=326.574，P=0.000；F=533.813，P=0.000；F=126.576，P=0.000；F=143.645，P=0.000；F=203.744，P=0.000)。與Control組相比，mimic-NC組細(xì)胞磷脂和三酰甘油含量及FASN、ACC1、FABP5蛋白表達(dá)均無變化(P>0.05)，miR-17 mimic組細(xì)胞磷脂和三酰甘油含量均降低(P<0.01)，F(xiàn)ASN、ACC1、FABP5蛋白表達(dá)均下調(diào)(P<0.01)。見圖3。

2.4 CD36逆轉(zhuǎn)了miR-17對非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞生長、轉(zhuǎn)移和脂肪酸代謝的調(diào)控各組間CD36蛋白表達(dá)水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=187.394，P=0.000)。與Control組相比，mimic-NC組CD36蛋白表達(dá)均無明顯變化，miR-17 mimic組細(xì)胞CD36蛋白表達(dá)均明顯下調(diào)(P<0.01)。各組間克隆細(xì)胞數(shù)目、劃痕閉合率、侵襲細(xì)胞數(shù)目、磷脂和三酰甘油含量、FASN、ACC1、FABP5蛋白表達(dá)水平，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F=686.457，P=0.000；F=592.341，P=0.000；F=964.162，P=0.000；F=346.242，P=0.000；F=564.183，P=0.000；F=193.465，P=0.000；F=206.497，P=0.000；F=239.674，P=0.000)。與miR-17 mimic組相比，miR-17 mimic + pc-CD36組細(xì)胞克隆數(shù)目增加(P<0.01)，劃痕閉合率升高(P<0.01)，侵襲細(xì)胞數(shù)目增加(P<0.01)，磷脂和三酰甘油含量均升高(P<0.01)，F(xiàn)ASN、ACC1、FABP5蛋白表達(dá)均上調(diào)(P<0.01)，見圖4、5。

圖2 miR-17抑制NSCLC細(xì)胞A549的細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移

圖3 miR-17抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中脂質(zhì)代謝

圖4 CD36逆轉(zhuǎn)了miR-17對非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移的調(diào)控

圖5 CD36逆轉(zhuǎn)了miR-17對非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞脂質(zhì)代謝的調(diào)控

2.5 miR-17靶向SCD調(diào)控CD36通過TargetScan數(shù)據(jù)庫的預(yù)測miR-17與硬脂酰輔酶A去飽和酶(stearoyl CoA desaturase，SCD)的3′UTR存在結(jié)合位點(圖6A)。雙熒光素酶測定發(fā)現(xiàn)，各組間熒光素酶活性差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=843.643，P=0.000)；miR-17 mimic明顯抑制了含有野生型SCD質(zhì)粒的熒光素酶活性(P<0.01)，但對突變型SCD質(zhì)粒的熒光素酶活性無影響(P>0.05)。各組間CD36表達(dá)水平，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=163.454，P=0.000)；與miR-17 mimic組相比，miR-17 mimic + pc-SCD組細(xì)胞中CD36蛋白表達(dá)均上調(diào)(P<0.01)。見圖6。

圖6 miR-17靶向SCD調(diào)控CD36

3 討論

盡管近年來NSCLC的診斷和治療取得了很大的進步，但5年生存率仍然很低，復(fù)發(fā)和死亡率也仍然很高。 因此，急需進一步研究NSCLC的分子靶點和機制來改善NSCLC的治療。miRNA參與包括細(xì)胞增殖、生長、分化、凋亡等多種生物學(xué)過程。miR-17是常見抑癌基因之一，同Huang et al[4]研究結(jié)果miR-17在NSCLC中低表達(dá)相一致，本研究結(jié)果表明：與正常肺細(xì)胞BEAS-2B相比，非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系(H1703、A549、H1299、L78、PGCL3、H460)中miR-17 mRNA的表達(dá)明顯下調(diào)。研究還發(fā)現(xiàn)高表達(dá)miR-17能夠明顯減少A549細(xì)胞克隆數(shù)目、降低劃痕閉合率、減少侵襲細(xì)胞數(shù)目，說明miR-17抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549的細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移。

有研究[7]顯示，miRNA在葡萄糖代謝，脂肪代謝和氨基酸代謝等能量代謝中起重要作用，如miR-181a通過異檸檬酸脫氫酶1調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝。脂質(zhì)代謝的改變已被公認(rèn)是癌細(xì)胞的標(biāo)志性特征。脂質(zhì)主要包括脂肪酸、甘油三酸酯和膽固醇，脂肪酸是癌細(xì)胞中能量存儲、膜合成、信號分子生成所需的基本底物[8]。而在癌癥的發(fā)展過程中，脂肪酸代謝途徑的改變不僅為癌癥的發(fā)生和發(fā)展提供能量，而且在生物膜大分子和信號分子中也起著重要的作用[9]。為了研究miR-17對NSCLC細(xì)胞脂肪酸代謝的影響，測定了脂質(zhì)和關(guān)鍵脂質(zhì)代謝酶的細(xì)胞內(nèi)含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)miR-17明顯降低A549細(xì)胞內(nèi)磷脂和三酰甘油含量，下調(diào)FASN、ACC1、FABP5蛋白表達(dá)，說明miR-17抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中脂肪酸代謝。

CD36是脂質(zhì)和脂肪酸的受體，在代謝綜合征和相關(guān)的心臟活動中起重要作用，參與脂質(zhì)代謝、長鏈脂肪酸吸附、凋亡殘基清除和巨噬細(xì)胞吞噬作用[10]。CD36調(diào)節(jié)的脂肪酸代謝與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，如外源性脂質(zhì)通過CD36促進乳腺癌細(xì)胞的生長[11]。脂肪酸受體CD36和脂質(zhì)代謝基因具有啟動細(xì)胞轉(zhuǎn)移的能力，如棕櫚酸通過CD36啟動癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移潛能[12]。本研究顯示，高表達(dá)miR-17下調(diào)A549細(xì)胞CD36蛋白表達(dá)。隨后共轉(zhuǎn)染pc-CD36質(zhì)粒發(fā)現(xiàn)，CD36的上調(diào)逆轉(zhuǎn)了miR-17對非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞生長、轉(zhuǎn)移和脂肪酸代謝的調(diào)控。

為了研究miR-17調(diào)節(jié)CD36表達(dá)的詳細(xì)機制，通過TargetScan數(shù)據(jù)庫的預(yù)測SCD是miR-17的直接靶標(biāo)。SCD一種負(fù)責(zé)脂肪酸合成的限速酶，參與維持細(xì)胞快速增殖，逃避細(xì)胞凋亡，促進各種類型癌癥中的癌細(xì)胞起始和惡性轉(zhuǎn)化[13]。SCD在肺癌、乳腺癌和前列腺癌等多種癌癥中發(fā)現(xiàn)高表達(dá)，具有致癌作用[14]。SCD可通過調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激來調(diào)節(jié)肝腫瘤啟動細(xì)胞[15]。本研究結(jié)果表明，SCD的上調(diào)逆轉(zhuǎn)了miR-17高表達(dá)對CD36表達(dá)的抑制作用，說明miR-17通過靶向下調(diào)SCD來調(diào)控CD36表達(dá)，進而影響CD36介導(dǎo)的脂肪酸代謝，從而抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞生長和遷移。綜上所述，miR-17靶向SCD通過調(diào)節(jié)CD36介導(dǎo)的脂肪酸代謝來抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移，為臨床治療非小細(xì)胞肺癌提供一種新的治療方法，但更為動物體內(nèi)實驗還有待進一步研究。