楊利斌，楊 林，王善坤，趙恩典，路 坦，梁秋冬

椎間盤易受損傷而發(fā)生形態(tài)學(xué)改變，因此造成疼痛性癥狀和神經(jīng)功能損傷給患者家庭和社會造成了沉重的壓力[1-2]。目前，椎間盤退變(intervertebral disc degeneration，IDD)的治療方法包括保守治療、椎間盤切除和脊柱融合等，但這些方法療效有限，不能產(chǎn)生可預(yù)測和可靠的結(jié)果[3-4]。研究[2,5]表明，炎癥微環(huán)境和新神經(jīng)支配產(chǎn)生是椎間盤性疼痛的來源，其中白介素1β(interleukin-1β, IL-1β)可影響椎間盤細胞衰老、自噬和與增殖、再生有關(guān)的基因表達。微小RNA(microRNAs, miRNAs)對編碼基因表達有負性調(diào)控作用，參與炎癥性疾病的調(diào)控[6]。研究[7]表明，miR-155在髓核細胞變性過程中表達下調(diào)。但miR-155對大鼠椎間盤細胞凋亡、炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激的影響尚不清楚?；诖耍撐奶骄縨iR-155對IL-1β誘導(dǎo)的大鼠髓核細胞凋亡、炎癥和氧化應(yīng)激的作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物 清潔級SD大鼠10只，雌雄不限，180～220 g，購自北京維通利華實驗動物公司[SCXK(京)2015-0001]。飼養(yǎng)于新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院實驗室，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，溫度(25±2)℃，濕度(40±5)%，光照10～12 h，自由采食和飲水。試驗均經(jīng)過本院動物倫理委員會批準，并按照實驗動物使用的3R原則給予人道關(guān)懷。

1.1.2主要試劑 Ⅱ型膠原酶(C6885)、0.25%胰蛋白酶(T6424)和IL-1β(SRP3083)購自美國Sigma公司；TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒(T2190)、軟骨染色液(甲苯胺藍法)(G2543)、軟骨染色液(番紅O法)(G2540)、總RNA提取試劑盒(R1200)、定量PCR試劑盒(T2210)購自索萊寶公司；DMEM/F12培養(yǎng)液(11320082)、青鏈霉素溶液(15070063)、胎牛血清(12483020)購自美國Gibco公司；miR-155 mimic、miR-155 inhibitor和陰性質(zhì)粒購自美國Hyclone公司；兔源Caspase-3(ab4051)、Caspase-9(ab32539)、p-p65(ab76302)、p65(ab32536)、TNF-α(ab221921)和GAPDH(ab181602)單克隆抗體購自Abcam公司；引物使用Primer5.0軟件設(shè)計，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1大鼠髓核細胞培養(yǎng)[8]CO2麻醉法處死大鼠，75%酒精體表浸泡消毒；分離胸腰段脊柱，充分暴露椎間盤，髓核組織；磷酸鹽緩沖液(PBS)液漂洗，切成約1 mm3組織塊，移入滅菌離心管，加0.1% Ⅱ型膠原酶，37 ℃振蕩消化30 min；1 000 r/min×5 min，棄上清液；PBS液漂洗；加0.1% Ⅱ型膠原酶重懸，37 ℃、5% CO2條件下孵育4 h；將細胞懸液用70 μm孔徑細胞篩網(wǎng)過濾，用DMEM/F 12離心洗滌；轉(zhuǎn)入25 cm2細胞培養(yǎng)瓶，加含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液，37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。觀察生長情況，一般4～5 d換液，去除未貼壁組織塊，以后每3 d換液1次，當細胞融合率達到85%時可進行傳代。取第2代細胞用于鑒定，第3代細胞進行后續(xù)實驗研究。

1.2.2髓核細胞鑒定 采用番紅O和甲苯胺藍染色進行：將第2代細胞接種于24孔板，待細胞貼壁后PBS充分洗滌；加4%多聚甲醛固定細胞30 min，PBS充分洗滌；用1%甲苯胺藍染色10 min或0.5%番紅O染液滴染1 min，雙蒸水洗滌1 min。鏡下觀察細胞染色情況及形態(tài)特征。

1.2.3細胞轉(zhuǎn)染 以1×105個/ml密度將第3代髓核細胞接種于6孔培養(yǎng)板中，待細胞貼壁后，分為4組：對照組、模型組、IL-1β+miR-155 mimic組和IL-1β+miR-155 inhibitor組。融合率達80%時，采用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染。對照組和模型組轉(zhuǎn)染miR-155陰性質(zhì)粒。24 h后，換無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12 h；再加入終濃度10 ng/ml的IL-1β處理，24 h后進行后續(xù)實驗。

1.2.4qRT-PCR檢測miR-155表達 以1×105個/ml密度將第3代髓核細胞接種于6孔培養(yǎng)板中，融合率達80%時，① 分為Control組(對照組)和IL-1β組(模型組)，前者不作處理，后者加入終濃度10 ng/ml的IL-1β；② 分為對照組和miR-155 mimic組，前者轉(zhuǎn)染miR-155陰性質(zhì)粒，后者轉(zhuǎn)染miR-155 mimic；③ 分為對照組和miR-155 inhibitor組，轉(zhuǎn)染miR-155陰性質(zhì)粒，后者轉(zhuǎn)染miR-155 inhibitor。

24 h后收集各組細胞，提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，之后進行qRT-PCR。引物：miR-155上游：5′-AAC TTG TAA ACT CCC TCG ACT G-3′，下游：5′-CCT TAC GTG ACC TGG AGT CG-3′；GAPDH上游：5′-CGC TCT CTG CTC CTC CTG TTC-3′，下游：5′-ATC CGT TGA CTC CGA CCT TCA C-3′。按照2-ΔΔCT法計算miR-155表達量。

1.2.5流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 按1.2.3項處理，收集各組細胞調(diào)整為1×106個/ml，每個樣本加入5 μl的膜聯(lián)蛋白V-熒光素異硫氰酸鹽(annexin V-fluorescein isothiocyanate, Annexin V-FITC)和5 μl碘化丙叮(propyl iodide, PI)染色液，室溫避光孵育15 min后上機檢測。

1.2.6ELISA檢測髓核細胞炎癥因子白介素6(interleukin-6, IL-6)、誘導(dǎo)性一氧化氮(inducible nitric oxide，iNOS)和白介素10(interleukin-10, IL-10)的表達 按1.2.3項處理后，按照說明書操作，檢測各組髓核細胞內(nèi)炎癥因子IL-6、iNOS和IL-10的表達水平。

1.2.7試劑盒檢測髓核細胞氧化應(yīng)激因子乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、 丙二醛(malondialdehyde，MDA)和谷胱甘肽(glutathione，GSH)的含量 按1.2.3項處理后，按照說明書操作，檢測各組髓核細胞內(nèi)氧化應(yīng)激因子LDH、SOD、 MDA和GSH含量。

1.2.8蛋白印跡檢測相關(guān)蛋白表達水平 按1.2.3項處理后，收集各組細胞提取總蛋白，用二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)法檢測蛋白濃度并調(diào)平，取30 μg蛋白用12%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)分離蛋白并轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜上，室溫封閉2 h，以1 ∶800稀釋度加入半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(cysteine aspartic protease 3, Caspase-3)、Caspase-9、核轉(zhuǎn)錄因子kappa B P65(nuclear transcription factor kappa B P65, NF-κB p65)、p-p65和TNF-α抗體，4 ℃孵育過夜。次日棄一抗，加入二抗室溫封閉1 h，滴發(fā)光液于暗室曝光顯影。以GAPDH為內(nèi)參計算蛋白相對表達量。

2 結(jié)果

2.1 原代培養(yǎng)大鼠髓核細胞的鑒定采用番紅和甲苯胺藍染色鑒定第二代髓核細胞，重復(fù)3次實驗的結(jié)果如圖1顯示：番紅染色后髓核細胞胞質(zhì)和核呈棕黃色，甲苯胺藍染色胞質(zhì)和核呈藍色；且兩種染色細胞均呈多邊形的“鋪路石”樣，符合髓核細胞(特殊的軟骨細胞)形態(tài)特點。

2.2 miR-155表達水平比較qRT-PCR檢測miR-155表達水平，結(jié)果如圖2顯示：與對照組相比，模型組miR-155表達水平降低(P<0.01)；miR-155 mimic組miR-155的表達增加(P<0.01)；miR-155 inhibitor組miR-155的表達降低(F=20.15，P<0.01)。

2.3 miR-155抑制IL-1β誘導(dǎo)的髓核細胞凋亡流式細胞術(shù)檢測各組細胞凋亡率，結(jié)果如圖3顯示：與對照組相比，模型組細胞凋亡率增加(F=19.56，P<0.01)；與模型組相比，miR-155 mimic降低IL-1β誘導(dǎo)的細胞凋亡率(F=15.24，P<0.01)，而miR-155 inhibitor增加細胞凋亡率(F=12.28，P<0.01)。蛋白印跡進一步檢測凋亡相關(guān)蛋白表達水平，結(jié)果如圖3顯示：與對照組相比，模型組髓核細胞中Caspase-3、Caspase-9蛋白表達水平增加(F=19.22，F(xiàn)=23.45，P<0.01)；與模型組相比，IL-1β+miR-155 mimic組Caspase-3、Caspase-9蛋白表達水平降低(F=13.14，F(xiàn)=18.52，P<0.01)，而IL-1β+miR-155 inhibitor組Caspase-3、Caspase-9蛋白表達水平則上調(diào)(F=25.24，F(xiàn)=16.59，P<0.01)。

圖1 番紅和甲苯胺藍染色鑒定大鼠髓核細胞 ×400

2.4 miR-155抑制IL-1β誘導(dǎo)的髓核細胞炎癥反應(yīng)ELISA檢測各組髓核細胞中炎癥細胞因子的表達水平，結(jié)果顯示：與對照組相比，模型組髓核細胞中IL-6、iNOS表達增加，IL-10表達降低(F=23.54、F=14.55、12.53，P<0.01)；與模型組相比，IL-1β+miR-155 mimic組IL-6、iNOS表達降低，IL-10增加(F=10.88、8.69、12.41，P<0.01)，而miR-155 inhibitor組IL-6、iNOS表達增加，IL-10降低(F=11.26、8.61、8.27，P<0.01)。見圖4。

2.5 miR-155抑制IL-1β誘導(dǎo)的髓核細胞氧化應(yīng)激ELISA檢測各組髓核細胞中氧化應(yīng)激因子的含量，結(jié)果顯示：與對照組相比，模型組髓核細胞中SOD、GSH含量降低，MDA、LDH含量升高(F=32.56、29.62、25.46、23.47，P<0.01)；miR-155 mimic部分逆轉(zhuǎn)了IL-1β對上述氧化應(yīng)激分子的調(diào)節(jié)作用(F=15.47、19.25、12.36、16.48，P<0.01)，miR-155 inhibitor則加劇了IL-1β的調(diào)節(jié)作用(F=12.19、8.69、13.44、8.79，P<0.01)。見圖5。

2.6 miR-155抑制IL-1β誘導(dǎo)的髓核細胞NF-κB p65磷酸化、TNF-α表達和P65入核蛋白印跡實驗檢測各組髓核細胞NF-κB p65磷酸化情況，及下游TNF-α表達水平，結(jié)果顯示：與對照組相比，模型組p-p65/p65和TNF-α相對表達量增加(F=10.28、21.49，P<0.01；與模型組相比，IL-1β+miR-155 mimic組p-p65/p65和TNF-α表達水平降低(F=8.92、12.56，P<0.01)，而miR-155 inhibitor組p-p65/p65和TNF-α表達水平則增加(F=33.59、26.74，P<0.01)。見圖6。

圖3 miR-155對IL-1β誘導(dǎo)的髓核細胞凋亡和凋亡相關(guān)蛋白表達的影響

圖4 miR-155對髓核細胞炎癥細胞因子含量的影響

3 討論

炎癥細胞因子IL-1β是IL-1家族中最重要的成員，參與調(diào)節(jié)機體免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)過程，加速多種炎癥性疾病的進程[9]。Kang et al[10]研究發(fā)現(xiàn)，IL-1β刺激髓核細胞后，細胞外基質(zhì)降解增加，推進椎間盤退化的發(fā)展，而miR-15b的表達抑制成功干擾了該進程。在本研究中，成功采用Ⅱ型膠原酶法分離得到較純的大鼠髓核細胞，并用10 ng/ml的IL-1β處理髓核細胞以建立椎間盤退變細胞模型。IL-1β刺激降低了髓核細胞中miR-155的表達量，這可能與引起促炎細胞因子過度產(chǎn)生有關(guān)。

圖5 miR-155對髓核細胞氧化應(yīng)激因子表達的影響

圖6 miR-155對髓核細胞p-p65、TNF-α表達的影響

在變性的椎間盤組織中，炎性細胞因子水平升高，持續(xù)壓迫脊髓或神經(jīng)根，激活iNOS，產(chǎn)生大量一氧化氮，進一步增加受損區(qū)域的iNOS表達，進而誘導(dǎo)過度的髓核細胞凋亡，從而導(dǎo)致椎間盤退化[11]。本研究也證實，IL-1β處理大鼠髓核細胞后，促炎細胞因子大量表達，而抗炎細胞因子表達減少；可見，在椎間盤退變過程中，炎性細胞因子的含量增加是必然過程。大量研究[12]表明，在老化和退變的椎間盤中存在氧化應(yīng)激和氧化產(chǎn)物濃度的增加，并通過線粒體途徑誘導(dǎo)髓核細胞凋亡，是椎間盤退變的發(fā)病機制之一。該實驗結(jié)果也表明，在IL-1β誘導(dǎo)的椎間盤退變細胞模型中存在氧化應(yīng)激和產(chǎn)物消除的平衡失調(diào)，但miR-155過表達成功減少了髓核細胞內(nèi)炎癥細胞因子和氧化應(yīng)激分子的產(chǎn)生，加速了氧化產(chǎn)物的消除，進而降低了髓核細胞凋亡率和凋亡關(guān)鍵蛋白表達水平，而抑制miR-155表達則加速了髓核細胞凋亡進程。綜合實驗結(jié)果表明，miR-155能降低IL-1β誘導(dǎo)的椎間盤退變細胞模型髓核細胞的體外凋亡水平。

NF-κB 是一種多向性核轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，P50/P65 二聚體是其最常見形式，NF-κB 激活入核后可調(diào)節(jié)炎癥介質(zhì)、細胞因子等表達[13]。NF-κB信號通路在多種疾病中均有重要的調(diào)節(jié)作用，在骨關(guān)節(jié)炎細胞中，NF-κB p65磷酸化水平升高，進而增加其下游TNF-α等炎性細胞因子的表達[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-155過表達能有效降低p65入核量，進而抑制p-p65和下游炎性細胞因子TNF-α的表達水平，從而減少因此造成的髓核細胞凋亡。這與王金海等[15]的觀點基本一致。綜合實驗結(jié)果表明，在IL-1β誘導(dǎo)的椎間盤退變細胞模型中，miR-155降低髓核細胞凋亡的機制與抑制NF-κB信號通路激活有關(guān)，但其中是否還有其他信號途徑的參與還有待進一步研究。

綜上所述，Ⅱ型膠原酶可分離得到純度較高的大鼠髓核細胞，miR-155表達增加能有效降低IL-1β誘導(dǎo)大鼠髓核細胞凋亡、炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激，且可能與抑制NF-κB信號通路有關(guān)。該文旨在為椎間盤退化的治療提供一個新的方向。