汪丹丹，周偉杰，王 霧，蔣夢雅，楊 梅，陳鏡宇，魏 偉

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是最常見的惡性腫瘤之一，死亡率僅次于肺癌和胃癌。在世界范圍內(nèi)，每年因HCC死亡的人數(shù)超過74.5萬，而中國約占5.5%[1-3]。目前，HCC最有效的治療方法是手術(shù)治療，但對于不能耐受手術(shù)、術(shù)后復發(fā)以及晚期有轉(zhuǎn)移的患者，化療仍是主要的治療手段。細胞凋亡是正常機體細胞自主性、有序死亡的過程，而細胞的凋亡抵抗是導致腫瘤化療效果差的主要原因。CXCL12又被稱為SDF-1(stromal cell-derived factor 1)，是可與CXCR4(G蛋白偶聯(lián)受體)特異性結(jié)合的一種趨化因子，不僅可促進腫瘤細胞的遷移，還可以促進細胞存活，抑制細胞凋亡。在子宮內(nèi)膜癌中，CXCL12與CXCR4作用時可明顯減少細胞的凋亡。PI3Kβ屬于IA型PI3K，主要由催化亞基p110β和調(diào)節(jié)亞基p85組成，與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)。有文獻表明CXCL12與CXCR4結(jié)合后可引起PI3K/AKT的活化[4]，且PI3K/AKT的活化與胃癌、急性髓系白血病等腫瘤細胞凋亡密切相關(guān)[5-6]，但CXCL12對肝癌細胞凋亡的影響尚不明確。該研究探討CXCL12對肝癌細胞hepG2凋亡的影響及其與PI3K/AKT信號的關(guān)系，為肝癌細胞的凋亡及機制研究提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞株 人肝癌細胞株HepG2購買自中科院上海細胞庫。

1.1.2試劑及儀器 鼠單克隆抗體β-actin 和兔單克隆抗體p110β購買自美國Proteintech公司；兔多克隆抗體p85(phospho Y464)購買自英國Abcam公司；兔單克隆抗體p85、兔源AKT及AKT(phospho Ser473)均購買自美國Cell Signaling Technology公司；兔單克隆抗體Bax、兔單克隆抗體Bcl-2均購買自美國Bioworld Technology公司；重組小鼠SDF-1α(CXCL12)購買自美國Peprotech公司；胎牛血清和DMEM均購買自以色列Biological Industries公司；Annexin V-FITC細胞凋亡試劑盒購買自上海貝博生物科技有限公司；LY294002購買自美國APExBIO Technology公司；激光共聚焦顯微鏡(德國萊卡公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1細胞培養(yǎng) 將人肝癌HepG2 細胞置于5% CO2、37 ℃ 恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，并用含有10%胎牛血清，1%青-鏈霉素的培養(yǎng)基進行換液、傳代。當培養(yǎng)瓶(皿)中細胞密度長至80%左右時開始進行相關(guān)實驗。

1.2.2流式細胞儀檢測細胞凋亡 當細胞培養(yǎng)板中HepG2 細胞密度長至80%左右時，加入100 ng/ml CXCL12、20 μmol/L PI3K抑制劑(LY294002)，作用不同時間后，用不含EDTA的胰酶進行消化，收集細胞，按照凋亡試劑盒說明書進行操作，用流式細胞儀進行檢測。

1.2.3Western blot法檢測PI3K、AKT及凋亡相關(guān)蛋白的表達 當細胞培養(yǎng)板中HepG2 細胞密度長至80%左右時，加入100 ng/ml CXCL12作用5 min、20 μmol/L PI3K抑制劑(LY294002)作用1 h，收集細胞，在冰上用細胞裂解液進行裂解，于離心機上11 441 r/min離心15 min，取上清備用。在上清液中加入蛋白上樣緩沖液，開水中煮沸9 min使其變性。進行聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉等操作，之后分別加入相應的一抗(β-actin、p110β、p85、p-p85、AKT、p-AKT、Bax和Bcl-2)，4 ℃ 孵育過夜，加入相應二抗于37 ℃ 孵育2 h，通過化學發(fā)光成像儀進行結(jié)果檢測。

1.2.4激光共聚焦法檢測凋亡相關(guān)蛋白的表達 將消化后的細胞接種在含有無菌載玻片的24孔板，培養(yǎng)待細胞貼壁后，加入CXCL12刺激5 min，加入LY294002作用1 h，用組織固定液對細胞進行固定，5%BSA進行封閉，之后加入相應一抗(Bax或Bcl-2)孵育過夜，二抗室溫孵育2 h，DAPI通透5 min，滴加少量防熒光淬滅劑進行封片，最后通過激光共聚焦顯微鏡進行拍片。

1.3 統(tǒng)計學處理采用GraphPad Prism 6.01軟件進行統(tǒng)計學分析，多組間差異的比較采用單因素方差分析(ANOVA)，兩組之間比較用t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 CXCL12對HepG2細胞凋亡的影響由圖1 A、1B可知，與0 min組(不加CXCL12刺激時)相比，CXCL12(100 ng/ml)作用5、10、15、30、60 min后，hepG2細胞的凋亡比例均減少(F=6.733，P<0.05)，且不同時間點加入CXCL12作用組(實驗處理組)與陰性對照組相比，細胞凋亡比例均減少(P=0.024 9)，見圖1C。由圖1D、1E可知，與空白對照組相比，CXCL12(100 ng/ml)刺激5 min后，hepG2細胞凋亡比例下降(F=80.84，P<0.01)；在100 ng/ml CXCL12的體系中加入PI3K抑制劑(LY294002)時，hepG2細胞的凋亡比例與CXCL12組相比升高(F=80.84，P<0.01)。提示CXCL12可以抑制hepG2細胞凋亡，此作用可能與PI3K活化有關(guān)。

2.2 CXCL12對HepG2細胞凋亡相關(guān)蛋白表達的影響與空白對照組相比，CXCL12(100 ng/ml)上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(FWB=48.67、FIF=26.29，P<0.01)；與CXCL12組相比，PI3K抑制劑LY294002下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見圖2A、2B、2E、2G。與空白對照組相比，100 ng/ml CXCL12下調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達(FWB=24.61、FIF=12.05，P<0.01)；與CXCL12組相比，PI3K抑制劑LY294002上調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達(P<0.01)，見圖2C、2D、2F、2H。

2.3 CXCL12對PI3K/AKT通路活化的影響與空白對照組相比，100 ng/ml CXCL12可以上調(diào)p-p85(F=18.77)和p-AKT(F=18.63)蛋白的表達，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；加入PI3K抑制劑LY294002后可以下調(diào)p-p85和p-AKT蛋白的表達，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見圖3A、3C和3D。與空白對照組相比，100 ng/ml CXCL12不影響p110β、p85及AKT總蛋白的表達(Fp110β=0.05154、Fp85=0.2990、FAKT=2.197，P>0.05)差異無統(tǒng)計學意義；加入PI3K抑制劑LY294002后，不影響p110β、p85及AKT總蛋白的表達，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖3A、3B。提示CXCL12可以誘導p85和AKT的磷酸化，活化PI3K/AKT通路。

圖1 CXCL12對hepG2細胞凋亡的影響

圖2 CXCL12(100 ng/ml)對hepG2細胞凋亡相關(guān)蛋白表達的影響

圖3 CXCL12(100 ng/ml)對PI3K/AKT通路相關(guān)蛋白表達的影響

3 討論

凋亡是細胞程序性死亡的一種方式，對正常組織的發(fā)育與穩(wěn)態(tài)平衡起著重要作用，凋亡功能的紊亂可以促進腫瘤細胞的生長。CXCL12/CXCR4信號與腫瘤細胞的凋亡密切相關(guān)。有研究表明，CXCR4在白血病、淋巴瘤、乳腺癌、肝癌、肺癌及前列腺癌細胞中表達升高[7]；在CXCR4陽性的腫瘤細胞中，CXCL12可以減少無血清培養(yǎng)時腫瘤細胞的凋亡；惡性膠質(zhì)瘤細胞中，CXCL12激活可以減少喜樹堿誘導的細胞凋亡[8]。此外，在非小細胞肺癌中，CXCL12也可通過激活JAK2/STAT3通路抑制順鉑誘導的細胞凋亡[9]。與上述研究結(jié)果相一致，該研究結(jié)果顯示CXCL12可以抑制肝癌細胞hepG2的凋亡。

Bcl-2家族成員是細胞凋亡線粒體途徑的重要調(diào)節(jié)器，其家族成員主要包括Bcl-2、Bcl-XL、Bax及Bad等。Bcl-2蛋白作為抗凋亡調(diào)節(jié)子廣泛的參與細胞活動，Bax蛋白是一種促凋亡蛋白，通過與Bcl-2的同源二聚化和異源二聚化作用誘導細胞的死亡。文獻[10]報道細胞中Bcl-2蛋白的表達與腫瘤的分化及各種組織病理學高危因素具有顯著相關(guān)性。肝癌細胞中Bcl-2/Bax比值的升高可使細胞凋亡減少，加速肝癌細胞生長。此外，Bcl-2蛋白表達的增加還與肝癌化療藥物索拉菲尼耐藥性有關(guān)。該研究結(jié)果顯示，CXCL12可以上調(diào)肝癌細胞hepG2的抗凋亡蛋白Bcl-2水平，下調(diào)促凋亡蛋白Bax的水平，這提示CXCL12可以上調(diào)Bcl-2/Bax比值進而減少hepG2細胞凋亡。

PI3K是一種廣泛表達的重要的磷脂蛋白激酶，在細胞內(nèi)主要介導G蛋白偶聯(lián)受體和酪氨酸激酶信號的轉(zhuǎn)導[11]。當CXCL12與其特異性受體CXCR4結(jié)合時可引起下游信號分子PI3K/AKT的活化。研究[12]表明肝癌的生長與PI3K/AKT信號的活化有關(guān)，并且該通路在30%～50% 肝癌患者中被激活。Rab31可通過激活PI3K/AKT信號通路上調(diào)肝癌細胞Bcl-2/Bax的比值，減少細胞凋亡，進而加速癌細胞的生長；柳穿魚素可通過抑制 PI3K/AKT信號通路，抑制肝癌細胞活性，引起凋亡；此外，抑制 PI3K/AKT信號通路還可降低肝癌細胞的多藥耐藥性。本研究結(jié)果提示CXCL12可以增加p-p85及p-AKT蛋白的表達，因而誘導PI3K/AKT信號通路的活化，此作用可能與其抑制hepG2細胞凋亡有關(guān)。

綜上，CXCL12可以上調(diào)Bcl-2/Bax比值，抑制hepG2細胞的凋亡，其作用機制可能與PI3K/AKT信號通路的活化有關(guān)。CXCL12作為一種多功能的趨化因子，可以參與細胞的遷移、增殖、凋亡及血管生成等過程，其對腫瘤細胞的影響及機制還需要進一步深入研究。