代聰聰，吳立勝，繆 冉，朱志強

胃癌是人類世界癌癥醫(yī)學(xué)中最艱難的挑戰(zhàn)之一，其發(fā)病率在東亞最高，且其致死率也排在惡性癌癥的前列。胃癌是中國最為常見的癌癥之一，僅次于肺癌。伴著醫(yī)療行業(yè)整體的不停進步，胃癌的診斷方法及治療手段得到很大程度的提升，但胃癌的局部復(fù)發(fā)和遠處轉(zhuǎn)移依然影響著患者的生存預(yù)后，胃癌病人現(xiàn)階段的5年生存率仍不能達到比較滿意的水平[1-2]。因此，探索影響胃癌轉(zhuǎn)移機制的生物新靶點對于提高胃癌患者生存預(yù)后有重大意義。

6-甲基腺苷(N6-methyladenosine, m6A)屬于真核生物mRNA轉(zhuǎn)錄后修飾中含量最為豐富的一種方式，對調(diào)節(jié)mRNA剪接、翻譯和穩(wěn)定性等方面有著非常重要的影響。m6A動態(tài)調(diào)控蛋白包含甲基轉(zhuǎn)移酶(Writers)，去甲基化酶(Erasers)及讀取基因(Readers)這三類[3]。甲基轉(zhuǎn)移酶被發(fā)現(xiàn)是一種可以催化甲基化過程的多因子復(fù)合物，是由METTL3、METTL14、WTAP、VIRMA、RBM15和ZC3H13蛋白組成的[4]。已有研究[4-9]表明，m6A相關(guān)蛋白以不同的角色影響腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，如乳腺癌、急性髓性白血病、膽管癌、肝細胞癌和膀胱癌等。VIRMA作為近年來發(fā)現(xiàn)的m6A甲基轉(zhuǎn)移酶的重要組成部分，尚不清楚其在胃癌的發(fā)生和發(fā)展進程中的具體作用。該研究構(gòu)建VIRMA干擾胃癌細胞株，探究其對胃癌細胞遷移功能的影響并對其機制進行初步探究。

1 材料與方法

1.1 細胞來源及細胞培養(yǎng)人胃癌MGC803和SGC7901細胞株從中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細胞生物學(xué)研究所購入。胃癌細胞MGC803和SGC7901細胞株在有1%鏈霉素-青霉素混合物(美國Gibco公司)和10%胎牛血清(美國Gibco公司)的1640培養(yǎng)基(美國Gibco公司)中進行培養(yǎng)，在溫度37 ℃、CO2體積為5%的細胞培養(yǎng)箱(美國Thermo Fisher Scientific公司)中進行培養(yǎng)。

1.2 細胞轉(zhuǎn)染用含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液培養(yǎng)人胃癌MGC803和SGC7901細胞至細胞融合度為60%～70%，然后按照相關(guān)制造商的說明書(上海Obio公司)，用VIRMA干擾慢病毒和pLKD-CMV-G &PR-U6陰性對照載體感染細胞，感染細胞24 h后使用新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。然后用內(nèi)含10%胎牛血清和8 μg/ml嘌呤霉素的1640培養(yǎng)液培養(yǎng)篩選2周，擴增篩選后的細胞株，將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的干擾組和對照組胃癌細胞分別命名為shVIRMA組和shRNA-NC組。

1.3 實時熒光定量PCR對培育的胃癌細胞中使用TRIzol試劑(美國Invitrogen公司)萃取細胞中總的RNA，用Primescript RT試劑(日本TaKaRa 公司)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。用ChamQ SYBR qPCR Master Mix試劑盒(南京諾唯贊生物公司)進行qRT-PCR的mRNA檢測和分析。應(yīng)用于qRT-PCR的引物序列:VIRMA上游序列：5′-GAGTAAGAGCCCATAGCA GT-3′，下游序列: 5′-TAGCACCAGACCATCAGTA TTCAC-3′；FN1上游序列: 5′-AGGAAGCCGAGGTT TTAACTG-3′，下游序列: 5′-AGGACGCTCATAAGTG TCACC-3′；β-actin上游序列: 5′-AGCGAGCATC CCCCAAAGTT-3′，下游序列: 5′-GGGCACGAAGG CTCATCATT-3′。PCR實驗的化學(xué)反應(yīng)的總體積為10 μl：Mix 5 μl、Rox 0.2 μl、上游和下游引物各0.2 μl、ddH2O 3.4 μl、cDNA 1 μl。PCR實驗的化學(xué)反應(yīng)的擴增條件：95 ℃控溫開始進行預(yù)變性30 s；95 ℃控溫進行變性5 s；60 ℃進行控制溫度30 s，共擴增循環(huán)40次。參照選取β-actin，實驗設(shè)置3個副孔，選取2-ΔΔCt方法去計算mRNA表達量的相對變化。實驗操作均遵循試劑制造商的說明書。

1.4 蛋白質(zhì)印跡實驗挑選生長增殖情況處于優(yōu)良的胃癌細胞，遵循試劑說明書，加入裂解緩沖液及蛋白酶抑制劑(上海碧云天公司)，置于冰上15 min后刮取細胞裂解物，4 ℃的溫度下使用13 000 r/min的轉(zhuǎn)速進行離心12 min，抽取離心后的部分上層液體并按照BCA蛋白質(zhì)測定試劑盒(上海碧云天公司)的說明指導(dǎo)定量蛋白質(zhì)的濃度，后加入蛋白上樣緩沖液水浴煮沸變性6 min，保存在-80 ℃冰箱。制作濃度為13%的(SDS-PAGE)凝膠用于電泳，蛋白上樣后電泳，使用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜，脫脂牛奶封閉。清洗，分別放入相對應(yīng)一抗抗體中4 ℃過夜。次日洗膜，分別放入相對應(yīng)二抗抗體常溫置于搖床上孵育1 h。隨后洗膜，加入顯色液，曝光及觀察結(jié)果。

1.5 CCK-8實驗挑選生長增殖情況處于優(yōu)良的胃癌細胞，制備成細胞密度為16 000/ml的含血清細胞懸液，在96孔板的每個小孔中滴入100 μl的細胞懸液然后放置于培養(yǎng)箱中培育，每組細胞設(shè)置3個副孔。每隔24 h，滴入含有10% CCK-8的不含血清的1640培養(yǎng)基，在培養(yǎng)箱中放置培養(yǎng)1 h，然后應(yīng)用酶標(biāo)儀對實驗對象讀取其在450 nm的數(shù)據(jù)并分析。

1.6 Transwell實驗

1.6.1細胞遷移實驗 挑選生長增殖情況處于優(yōu)良的胃癌細胞，應(yīng)用胰酶消化離心后重新懸浮并吹打均勻下層積淀的細胞時應(yīng)用不含有血清的培養(yǎng)基，校準(zhǔn)細胞懸浮液的密度為2×105/ml。使用移液槍以200 μl的體積將細胞懸浮液滴入Transwell小室上室，在小室下室以650 μl的體積加入含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基，放在培養(yǎng)箱中繼續(xù)培育。24 h后從細胞培養(yǎng)箱中拿出Transwell小室，吸除上室培養(yǎng)液并應(yīng)用PBS仔細清洗3次，然后加入95%乙醇來固定，待35 min后吸除乙醇，自然情況下風(fēng)干小室。應(yīng)用0.1%結(jié)晶紫試劑對細胞染色35 min，后應(yīng)用PBS仔細清洗3遍。100倍光學(xué)顯微鏡下拍照及記數(shù)。

1.6.2細胞侵襲實驗 將Matrigel基質(zhì)膠(美國BD公司)和無血清1640培養(yǎng)基按照1 ∶15的溶液比例進行稀釋混合后，加入到Transwell小室的上層小室內(nèi)，在37 ℃培養(yǎng)箱中放置2 h待其成形為凝膠，后續(xù)實驗步驟與細胞遷移實驗相同。

1.7 細胞劃痕實驗挑選生長增殖情況處于優(yōu)良的胃癌細胞，按照每孔2×105個細胞的數(shù)量鋪在6孔板中，隨后將新鮮的含有10%血清的液體培養(yǎng)基加入6孔板，等候細胞增殖到生長融合度超過75%時，以100 μl移液槍頭為工具在直尺的輔助下劃十字直線于培養(yǎng)板上，應(yīng)用PBS仔細清洗3次，換入不含血清的液體培養(yǎng)基，應(yīng)用顯微鏡對劃線結(jié)果進行拍照，后放回培養(yǎng)箱中繼續(xù)培育。24 h后仔細吸除舊培養(yǎng)基，應(yīng)用PBS清洗3次，40倍光學(xué)顯微鏡下查看并拍照，然后進行測量及統(tǒng)計。

2 結(jié)果

2.1 慢病毒轉(zhuǎn)染成功抑制VIRMA mRNA表達使用pLKD-CMV-G &PR-U6陰性對照載體和VIRMA干擾慢病毒感染胃癌MGC803和SGC7901細胞，實時熒光定量PCR法檢測shRNA-NC組和shVIRMA組細胞中VIRMA mRNA的表達水平。相較于shRNA-NC組，shVIRMA組細胞中VIRMA mRNA的表達水平降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=10.52、15.54，P<0.05)。見圖1。

圖1 實時熒光定量PCR檢測VIRMA mRNA表達水平與shRNA-NC組比較：*P<0.05

2.2 慢病毒轉(zhuǎn)染成功抑制VIRMA蛋白表達使用蛋白質(zhì)印跡法檢測shRNA-NC組和shVIRMA組細胞中VIRMA蛋白的表達水平。結(jié)果顯示shVIRMA組細胞中VIRMA蛋白相對表達量低于shRNA-NC組。熒光定量PCR實驗的檢測結(jié)論與蛋白質(zhì)表達結(jié)論相一致，表明慢病毒在胃癌細胞中成功降低了VIRMA基因的表達，可在后續(xù)實驗中使用。差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=50.75、47.27，P<0.05)。見圖2。

圖2 蛋白質(zhì)印跡法檢測VIRMA 蛋白表達水平與shRNA-NC組比較：*P<0.05

2.3 干擾VIRMA抑制胃癌細胞的增值使用CCK-8法檢測shRNA-NC組和shVIRMA組的胃癌細胞增殖情況。結(jié)果顯示shVIRMA組胃癌細胞的生長能力弱于shRNA-NC組胃癌細胞，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=4.424、t=16.14；t=3.359、t=5.934，P<0.05)。見圖3。

圖3 CCK-8法檢測細胞增殖能力A：MGC803；B：SGC7901；與shVIRMA組比較：*P<0.05

2.4 干擾VIRMA抑制胃癌細胞的遷移對胃癌MGC803和SGC7901細胞分別進行Transwell細胞實驗。24 h后shRNA-NC組胃癌細胞遷移和侵襲個數(shù)多于shVIRMA組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=15.42、42.68；t=22.48、14.59，P<0.05)。見圖4。

2.5 干擾VIRMA抑制胃癌細胞的劃痕愈合能力劃痕實驗進一步檢測及分析抑制VIRMA基因表達對胃癌細胞的遷移潛能的影響。24 h后shVIRMA組劃痕愈合率較shRNA-NC組低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=30.28；t=12.43，P<0.05)。見圖5。

圖4 Transwell實驗檢測胃癌細胞遷移和侵襲能力A：遷移實驗 ×100；B：侵襲實驗 ×40；與shRNA-NC組比較：*P<0.05

圖5 劃痕實驗檢測細胞遷移能力與shRNA-NC組比較：*P<0.05

2.6 干擾VIRMA影響FN1的mRNA和蛋白表達蛋白質(zhì)印跡法和實時熒光定量PCR法檢查干擾VIRMA基因后，胃癌細胞中FN1基因的表達變動程度。結(jié)果顯示，shVIRMA組和shRNA-NC組對比，F(xiàn)N1的mRNA和蛋白表達量均受到了抑制的影響，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t= 5.731、4.224；t=32.42、49.17，P<0.05)。見圖6。

圖6 胃癌細胞中FN1 mRNA和蛋白相對表達水平

3 討論

RNA甲基化已在mRNA、miRNA、incRNA、rRNA和snRNA等多種RNA中發(fā)現(xiàn)，m6A甲基化在真核細胞中為含量最為豐富的mRNA化學(xué)修飾。先前的研究[4-5]表明m6A修飾有許多動態(tài)蛋白參與調(diào)控，其中甲基轉(zhuǎn)移酶是由多個蛋白組成的復(fù)雜物質(zhì)，由METTL3、METTL14、WTAP、RBM15、VIRMA及ZC3H13幾個主要成分構(gòu)成。最近研究[6-10]表明，m6A相關(guān)蛋白與不同類型的癌癥細胞的發(fā)生和發(fā)展進程有一定的關(guān)系，如METTL3是急性髓性白血病生長的必須基因，是基于染色質(zhì)的這一途徑用于維持急性髓性白血病所需要的調(diào)節(jié)劑，METTL3基因表達的降低將導(dǎo)致癌癥細胞周期出現(xiàn)停滯，白血病細胞分化受阻。m6A甲基化修飾對于膠質(zhì)母細胞瘤干細胞(glioblastoma stem cells，GSC)腫瘤發(fā)生及自我更新進程至關(guān)重要，METTL14或METTL3基因的表達減少可以促進人GSC細胞的增殖。然而，GSC的增殖會因為RNA脫甲基酶FTO的降低或者METTL3的過量表達而受到抑制。WTAP過表達可以對膽管癌細胞的遷移和侵襲產(chǎn)生積極作用，干擾WTAP基因則降低膽管癌的侵襲和轉(zhuǎn)移[11]。ZC3H13通過調(diào)節(jié)K-ras和ERK信號的表達，在抑制結(jié)直腸癌中侵襲和增殖中發(fā)揮著重要作用[12]。VIRMA作為m6A甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物中的重要一員，但VIRMA在胃癌轉(zhuǎn)移中的作用仍未見相關(guān)研究。

為探究VIRMA對胃癌轉(zhuǎn)移的影響，使用慢病毒分別轉(zhuǎn)染胃癌MGC803和SGC 7901細胞，建立胃癌VIRMA干擾細胞株。結(jié)果表明，慢病毒干擾組的VIRMA mRNA和蛋白表達均較對照組降低，根據(jù)Transwell小室實驗結(jié)果及細胞劃痕實驗的測試結(jié)果，發(fā)現(xiàn)胃癌的劃痕愈合和遷移能力較實驗對照組均受到了抑制。因此，降低VIRMA基因的表達水平可以使胃癌的轉(zhuǎn)移能力受到抑制。

癌細胞與細胞外基質(zhì)的相互作用包括增殖、存活、侵襲和轉(zhuǎn)移等都對癌細胞至關(guān)重要，而FN1在細胞外基質(zhì)中含量豐富。FN1作為一種從屬于細胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)的糖蛋白，在多種類型的已知癌癥中表達比正常組織高，例如肛門癌、乳腺癌、頭頸部鱗癌和卵巢癌。功能試驗表明，F(xiàn)N1參與細胞增殖、胚胎發(fā)育、傷口愈合、血小板聚集宿主防御、凝血、EMT、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)過程。已有研究[13-15]報道FN1在一些腫瘤的轉(zhuǎn)移中發(fā)揮比較重要作用。如FN1的表達降低則抑制肺癌的遷移能力，誘導(dǎo)細胞凋亡。FN1也是皮膚鱗狀細胞癌、腦膠質(zhì)母細胞瘤和喉部鱗狀細胞癌等疾病進展和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵介質(zhì)。有研究證明通過激活MMP2/MMP9通路，F(xiàn)N1表達的增加可以對胃癌細胞的遷移和侵襲能力產(chǎn)生積極效應(yīng)。FN1也被認(rèn)為是胃癌的潛在預(yù)后生物標(biāo)志物。為了探討VIRMA參與胃癌轉(zhuǎn)移過程的相關(guān)分子機制，本研究選取了參與細胞運動和基質(zhì)侵襲轉(zhuǎn)移的基因FN1作為靶基因。

本研究顯示，VIRMA基因受到干擾后，降低了胃癌細胞株MGC803和SGC 7901的體外遷移能力，F(xiàn)N1基因的mRNA量和蛋白表達量也受到了降低的影響。這表明敲低VIRMA基因可以降低胃癌細胞的轉(zhuǎn)移潛能，可能與細胞外基質(zhì)糖蛋白分子FN1有關(guān)。綜上所述，本研究表明敲低甲基轉(zhuǎn)移酶VIRMA可抑制胃癌細胞的轉(zhuǎn)移能力，其機制可能與抑制細胞外基質(zhì)糖蛋白分子FN1的表達相關(guān)。