楊 熹, 丁永斌, 宋冬梅,葛 軍, 顏雪方

結腸癌是臨床常見的癌癥類型，是癌癥導致死亡的主要原因之一，癌基因的過度激活與抑癌基因的失活是導致結腸癌發(fā)生的主要因素[1]。目前對結腸癌的治療方案主要包括手術治療、化學治療、放射治療以及靶向治療[2]。手術治療是目前結腸癌治療的一線方案，然而由于腫瘤的轉移和復發(fā)，能夠取得的效果有限[3]。MicroRNA(miRNA)是一類非編碼RNA分子，在細胞分化、細胞增殖與生存等各個方面均發(fā)揮著重要的作用，miRNA可靶向結合于目的mRNA，導致目的mRNA翻譯抑制或者降解，miRNA在癌組織中的異常表達與癌癥的發(fā)生發(fā)展有著密切聯(lián)系，因此，基于miRNA的理論，目前已發(fā)展出了一系列全新的診斷和治療方案[4]。miR-373-3p是一種人類胚胎干細胞特異性的miRNA，研究表明，其在癌細胞中扮演著截然不同的角色。有證據指出miR-373-3p在一些癌癥中發(fā)揮著致癌基因的角色，然而，同樣有文獻報道了miR-373-3p對一些癌癥的抑制作用[5]。該研究在前人研究的基礎上，培養(yǎng)結腸癌細胞SW480，并通過miR-373-3p mimic和Rab22a過表達細胞株，探究了在結腸癌細胞中miR-373-3p與Rab蛋白22a(Rab22a)的相互作用關系及其調控作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑RPMI 1640培養(yǎng)液、胎牛血清購自美國Gibco公司；青鏈霉素、TRizol提取液、RIPA裂解液、BCA試劑盒、CCK-8試劑盒購自上海碧云天生物技術研究所；lipofectamine 2000購自美國Thermo Fisher公司；miR-373-3p mimic、陰性對照mimic(mimic NC)、Rab22a重組慢病毒由上海吉瑪制藥技術有限公司合成；所用引物由上海生工生物公司合成；Primescript RT Reagent kit和SYBR PremixEX Taq II試劑盒購自日本Takara公司；熒光素酶報告系統(tǒng)購自美國Promega公司；GAPDH、Rab22a、Ki67、上皮性鈣黏附蛋白(E-cadherin)、神經性鈣黏附蛋白(N-cadherin)抗體購自美國Santa Cruz公司。

1.2 細胞培養(yǎng)NCM460人正常結腸上皮細胞和SW480、SW620、HCT116和LOVO人結腸癌細胞株購自美國ATCC公司，使用加入了10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞，培養(yǎng)條件5%CO2、37 ℃。

1.3 細胞分組及處理將SW480細胞分為不經任何處理的結腸癌SW480細胞組(SW480組)、陰性對照組(mimic NC組)、miR-373-3p mimic組、pLV-Rab22a組、pLV-Rab22a+miR-373-3p組， mimic NC轉染mimic NC組細胞，miR-373-3p mimic轉染miR-373-3p組細胞，Rab22a重組慢病毒轉染pLV-Rab22a組、miR-373-3p mimic和Rab22a重組慢病毒共轉染pLV-Rab22a+miR-373-3p組，miRNA轉染的操作按照lipofectamine2000說明書進行。轉染48 h用于后續(xù)實驗。

1.4 結腸癌樣本獲取27例結腸癌組織及配對正常結腸組織樣本取自南京醫(yī)科大學附屬江蘇盛澤醫(yī)院2016年12月～2019年1月結腸癌患者手術切除標本，年齡37～77(61.33±12.27)歲，術前未經過任何放化療治療處理，樣本取材后使用液氮速凍，-80 ℃冰箱中保存，本研究已獲該院倫理委員會批準并取得患者或家屬同意。

1.5 慢病毒轉染SW480細胞取對數(shù)生長期的細胞接種于6孔板，細胞數(shù)量約為5×104個，細胞鋪滿板中70%時，每孔加入10 μl 1×108TU/ml重組慢病毒轉染24 h，換完全培養(yǎng)液5% CO2、37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)48 h，用于后續(xù)實驗。

1.6 RT-PCR檢測使用TRIzol溶液，抽提各組樣品總RNA，反轉錄獲得cDNA，根據SYBR PremixEX Taq Ⅱ試劑盒說明書進行RT-PCR檢測mRNA或miRNA水平，PCR按95 ℃預變性2 min，95 ℃變性5 s，60 ℃退火10 s，重復40個循環(huán)的條件進行擴增。通過2-ΔΔCt法進行計算。

1.7 熒光素酶實驗通過生物信息學預測miR-373-3p和Rab22a的靶向結合位點，根據位點序列構建pGL3 luciferase promoter野生型(wt)和突變型(mut)載體，載體分別與miR-373-3p mimic和mimic NC共轉染HEK293細胞，轉染48 h后檢測熒光素酶活性。

1.8 CCK-8檢測細胞增殖將各組細胞按1.3項的方法處理后，常規(guī)條件下繼續(xù)培養(yǎng)，每1 d使用CCK-8法測定細胞增殖倍數(shù)，連續(xù)測定3 d。測定時將細胞接種于96孔板，每孔10 μl的CCK8試劑處理4 h，通過酶標儀測定在450 nm的吸光度值。

1.9 劃痕法檢測細胞遷移細胞接種于6孔板，當細胞在板內鋪滿80%后，使用中等槍頭垂直于水平面進行劃線，使用PBS緩沖液清洗，在常規(guī)條件下繼續(xù)培養(yǎng)24 h，通過顯微鏡觀察劃痕愈合率。

1.10 Transwell法檢測細胞侵襲在Transwell小室中加入50 μl基質膠，37 ℃凝固3 h，上室和下室分別加入無血清培養(yǎng)液和完全培養(yǎng)液，細胞接種于上室，常規(guī)條件下培養(yǎng)48 h，擦洗掉未能通過膜的細胞，殘余細胞通過多聚甲醛進行固定，結晶紫染色后顯微鏡觀察。

1.11 Western blot檢測使用RIPA溶液，抽提各組樣品總蛋白，BCA試劑盒定量，根據蛋白濃度，在點樣孔中按每孔30 μg上樣量加樣，10% SDS-PAGE分離蛋白，半干轉膜法將蛋白轉至PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉2 h后，加入適量一抗4 ℃孵育過夜，PBS清洗后加入適量二抗繼續(xù)孵育2 h，ECL顯色液顯影。

2 結果

2.1 miR-373-3p在結腸癌組織和細胞中表達下調對27例臨床樣本進行RT-PCR檢測，如圖1所示，與配對正常結腸組織比較，結腸癌組織中miR-373-3p表達降低，差異有統(tǒng)計學意義(t=10.58,P<0.01)；對人正常結腸上皮細胞和結腸癌細胞進行RT-PCR檢測，與正常結腸上皮細胞株NCM460比較，SW480、SW620、HCT116和LOVO細胞株中miR-373-3p表達均下降，差異有統(tǒng)計學意義(F=35.44，P<0.01)。

2.2 miR-373-3p抑制Rab22a mRNA轉錄miR-373-3p轉染SW480細胞，并通過RT-PCR檢測細胞中miR-373-3p和Rab22a相對表達水平，如圖2所示，與SW480組比較，mimic NC組中miR-373-3p表達差異無統(tǒng)計學意義，miR-373-3p mimic組中miR-373-3p表達升高，差異有統(tǒng)計學意義(F=358.42，P<0.01)，表明miR-373-3p成功轉染了SW480細胞株；同時，與SW480組比較，mimic NC組Rab22a轉錄水平差異無統(tǒng)計學意義，miR-373-3p mimic組Rab22a轉錄水平降低，差異有統(tǒng)計學意義(F=92.33，P<0.01)。

2.3 miR-373-3p靶向作用于Rab22a生物信息學分析了miR-373-3p與Rab22a的相互作用位點，檢測熒光素酶活性，如圖3所示，與Rab22a WT+mimic NC組比較，Rab22a WT+miR-373-3p mimic組熒光素酶活性降低，差異有統(tǒng)計學意義(F=74.33，P<0.01)；同時，Rab22a MUT+miR-373-3p mimic組與Rab22a MUT+mimic NC組比較差異無統(tǒng)計學意義。

圖1 RT-PCR檢測miR-373-3p在結腸癌組織及細胞株中的表達

圖2 RT-PCR檢測SW480細胞株中miR-373-3p

圖3 熒光素報告基因檢測miR-373-3p與Rab22a靶向作用關系

2.4 miR-373-3p抑制細胞增殖通過CCK-8檢測了各組細胞在3 d內的細胞增殖水平，如圖4所示，與SW480組比較，miR-373-3p mimic組細胞增殖水平降低(F=178.42，P<0.01)，pLV-Rab22a組細胞增殖水平升高，差異有統(tǒng)計學意義(F=62.48，P<0.01)；與pLV-Rab22a組比較，pLV-Rab22a+miR-373-3p組SW480細胞增殖水平降低，差異有統(tǒng)計學意義(F=49.21，P<0.01)。

圖4 CCK-8檢測SW480細胞株細胞增殖水平

2.5 miR-373-3p抑制細胞遷移通過劃痕愈合法檢測了各組細胞的遷移能力，如圖5所示，SW480、miR-373-3p mimic、pLV-Rab22a、pLV-Rab22a+miR-373-3p各組細胞劃痕愈合率分別為(67.3±8.0%)、(26.8±5.1%)、(89.3±9.3%)、(51.0±6.5%)，與SW480組比較，miR-373-3p mimic組細胞劃痕愈合率降低(F=78.85，P<0.01)，pLV-Rab22a組細胞劃痕愈合率升高(F=31.43，P<0.01)，差異有統(tǒng)計學意義；與pLV-Rab22a組比較，pLV-Rab22a+miR-373-3p組細胞劃痕愈合率降低，差異有統(tǒng)計學意義(F=62.61，P<0.01)。

圖5 劃痕愈合法檢測SW480細胞株遷移能力 ×100

2.6 miR-373-3p抑制細胞侵襲通過Transwell法檢測了各組細胞的侵襲能力，如圖6所示，SW480、miR-373-3p mimic、pLV-Rab22a、pLV-Rab22a+miR-373-3p各組細胞侵襲數(shù)目分別為(147±11)、(56±7)、(241±22)、(134±15)，與SW480組比較，miR-373-3p mimic組細胞侵襲數(shù)目降低(F=89.30，P<0.01)，pLV-Rab22a組細胞侵襲數(shù)目升高(F=55.28，P<0.01)，差異有統(tǒng)計學意義；與pLV-Rab22a組比較，pLV-Rab22a+miR-373-3p組細胞侵襲數(shù)目降低，差異有統(tǒng)計學意義(F=75.35，P<0.01)。

2.7 miR-373-3p抑制Rab22a蛋白表達并調控增殖和轉移相關蛋白表達通過Western blot檢測了各組中Rab22a和增殖轉移相關蛋白的表達，如圖7所示，與SW480組比較，miR-373-3p mimic組Rab22a、Ki67、N-cadherin蛋白表達降低，E-cadherin蛋白表達升高(F=102.03，P<0.01)，同時pLV-Rab22a組Rab22a、Ki67、N-cadherin蛋白表達升高，E-cadherin蛋白表達降低(F=233.43，P<0.01)，差異有統(tǒng)計學意義；與pLV-Rab22a組比較，pLV-Rab22a+miR-373-3p組Rab22a、Ki67、N-cadherin蛋白表達降低，E-cadherin蛋白表達升高，差異有統(tǒng)計學意義(F=172.35，P<0.01)。

圖6 Transwell檢測SW480細胞株侵襲能力 ×200

3 討論

Rab家族屬于Ras小GTP酶超家族，在細胞內與蛋白囊泡運輸有著重要的關系，已有超過60種已知的Rab蛋白定位于不同的膜結合區(qū)域。這些GTP酶與GDP結合時處于失活狀態(tài)，與GTP結合時處于激活狀態(tài)，活化的Rab蛋白可與特定胞膜結合并促進效應因子復合物的形成，在膜識別、融合、膜脂成分改變、細胞器運動等各個方面起著重要作用[6]。Rab22a是Rab家族的成員之一，在內體囊泡轉運過程中發(fā)揮著關鍵作用，Rab22a過表達可導致內體形態(tài)改變，并妨礙內體向高爾基體的分子交流[7]。研究[8]表明，Rab22a在多種人類癌癥疾病中表達上調，在粘著斑形成、腫瘤細胞增殖、侵襲和遷移等過程中起著重要調節(jié)作用，被認為是一種致癌基因。Rab22a在結腸癌中也起著促進腫瘤發(fā)生的作用，Yin et al[9]報道了miR-204-5p可通過下調Rab22a的表達抑制結腸直腸癌細胞的增殖與侵襲，并增加其對化療藥物的敏感性。miR-373-3p是一種在人類胚胎干細胞中特異性高表達的miRNA[10]，在不同腫瘤組織中miR-373-3p呈現(xiàn)異常表達，根據腫瘤細胞類型的不同，分別發(fā)揮著促瘤和抑瘤的作用，表明miR-373-3p在腫瘤中的調控作用具有細胞特異性[11]。在結腸癌中，文獻報道了miR-373-3p具有腫瘤抑制作用，Tanaka et al[12]發(fā)現(xiàn)在結腸癌中miR-373-3p發(fā)生異常甲基化，導致表達量下調，同時促癌基因Rab22a mRNA表達水平升高；同時Zhang et al[13]研究表明在卵巢癌中miR-373-3p通過靶向下調Rab22a表達抑制腫瘤侵襲和轉移，推測在結腸癌中miR-373-3p也可通過靶向下調Rab22a的表達抑制腫瘤生長和轉移。為了證實這一推測，本研究首先檢測了miR-373-3p在結腸癌組織和細胞中的表達水平，結果表明在結腸癌組織和細胞中miR-373-3p表達水平降低。進一步通過miR-373-3p mimic轉染SW480細胞株，結果顯示miR-373-3p抑制了Rab22a的轉錄和蛋白表達水平，證實了miR-373-3p對Rab22a存在調控作用。通過雙熒光素酶報告實驗，驗證了miR-373-3p與Rab22a的靶向作用關系。結合以上實驗結果表明miR-373-3p在SW480細胞內可靶向抑制Rab22a的表達。

圖7 Western blot檢測Rab22a、Ki67、N-cadherin、E-cadherin蛋白表達

細胞增殖不受限制、易發(fā)生轉化和轉移是腫瘤細胞主要特征，Rab22a具有促進結腸癌細胞增殖和轉移的作用[9]。為了進一步探究miR-373-3p靶向作用于Rab22a對結腸癌細胞SW480的增殖和轉移的調控作用，本研究對SW480細胞增殖、遷移和侵襲等方面進行了檢測，結果表明miR-373-3p抑制了SW480細胞的增殖，Rab22a過表達可減輕miR-373-3p對增殖的抑制作用；同時，本研究顯示miR-373-3p抑制了SW480細胞的遷移和侵襲，Rab22a過表達可減輕miR-373-3p對遷移和侵襲的抑制作用。此外，miR-373-3p降低了Ki67和N-cadherin的蛋白表達，提高了E-cadherin的表達，Rab22a可逆轉miR-373-3p的調控作用。Ki67是常見的細胞增殖標志物，其水平變化可反映出細胞增殖的情況[14]；N-cadherin是一種間葉細胞標志物，E-cadherin是一種上皮細胞標志物，E-cadherin下調以及N-cadherin上調標志著細胞從上皮細胞向間葉細胞表型的轉變，細胞的遷移和侵襲能力提升[15-16]。結合以上實驗結果表明miR-373-3p可通過下調Rab22a表達抑制SW480細胞增殖和轉移。

綜上，在結腸癌細胞中，miR-373-3p可靶向作用于Rab22a，降低Rab22a的基因和蛋白表達水平，抑制Ki67和N-cadherin的表達，提高E-cadherin的表達，進而抑制結腸癌細胞的增殖、遷移和侵襲。本研究從體外水平SW480研究了miR-373-3p對Rab22a的靶向關系及其對結腸癌細胞增殖、遷移和侵襲的作用，今后考慮構建裸鼠移植瘤模型，進一步探討miR-373-3p和Rab22a在裸鼠體內的調控作用及機制。