曹 靚, 金 瑞, 孟祥云,王浩浩，李天立，劉小燕，王康林，吳繁榮, 臧洪梅

胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells, ESCs)是胚胎囊胚期內(nèi)細(xì)胞團(inner cell mass, ICM)衍生出的多能細(xì)胞，其具有產(chǎn)生人體內(nèi)所有分化細(xì)胞類型的能力[1]。近年來的一些研究闡明了miRNA-26(miR-26)簇(包括miRNA-26a和miRNA-26b)在發(fā)育中的作用，包括肌生成、成骨分化、胰腺細(xì)胞分化和肌肉分化[2-4]等。所有上述分化的組織或器官是從兩個胚層(中胚層和內(nèi)胚層)分化而來的。因此,該研究探討miR-26簇在ESCs中對多能性和分化的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1藥物與試劑 DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、β-巰基乙醇、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、慶大霉素購于美國GIBCO公司；白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor,LIF)購于美國Millipore公司；糖原合成酶激酶3β抑制劑(CHIR99021)、MAPK/ERK激酶抑制劑(PD0325901)購于英國Abcam公司；胰蛋白酶、碘化丙啶購于美國Sigma公司；脂質(zhì)體2000試劑、Alexa Fluor 488 Annexin V/Dead cell凋亡試劑盒、Alexa Fluor 488 Annexin V凋亡試劑盒購于美國Invitrogen公司；miRNA模擬物購于上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；CCK-8試劑盒購于日本同仁公司；藍色AP染色試劑盒購于美國SBI公司；BCA分析試劑盒購于美國ThermoFisher公司；Sox2、Otc4、 Nanog、GAPDH、α-Tubulin抗體購于英國Abcam公司。

1.1.2主要實驗儀器 IX71倒置熒光顯微鏡(日本Olympus公司)；Tecan Infinite M1000 PRO酶標(biāo)儀(瑞士Tecan公司)；超凈工作臺(美國Thermo公司)；超速離心機、高速冷凍離心機(德國ependorf公司)；Arial Ⅱ流式細(xì)胞儀(美國BD公司)；CO2培養(yǎng)箱、超低溫冰箱(美國Thermo公司)；7500熒光定量PCR儀(美國ABI公司)。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)和分化 在DMEM培養(yǎng)基中添加15% ES等級胎牛血清、55 mmol/L β-巰基乙醇、2 mmol/L L-谷氨酰胺、0.1 mmol/L非必需氨基酸、慶大霉素和1 000 U/ml LIF培養(yǎng)小鼠E14Tg2A(E14)細(xì)胞。為定期維持細(xì)胞株，將糖原合成酶激酶3β抑制劑和MAPK/ERK激酶抑制劑分別加入3 μmol/L和0.2 μmol/L。細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶解離，每2～3 d傳代1次。

1.2.2miRNA過表達 將mESCs細(xì)胞E14接種于明膠包被12孔，密度為每孔1×105個細(xì)胞，第0天用脂質(zhì)體2000試劑轉(zhuǎn)染50 nmol/L miR-26b的miRNA模擬物(miRNA mimics)。miR-26b模擬物序列(F:uucaaguaauucaggauaggu；R:aaguucauuaaguccuaucca) 。

1.2.3胚狀體(embryoid bodies, EB)的形成及誘導(dǎo)分化 采用懸滴法在10 cm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)細(xì)胞，并在第2天(即分化開始的第0天)去除LIF。采用懸滴法形成EB后，將EB轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿中進行懸浮培養(yǎng)，最長可達8 d。

1.2.4RNA提取、cDNA合成及實時定量PCR 總RNA按標(biāo)準(zhǔn)程序用TRIzol試劑提取。反轉(zhuǎn)錄用標(biāo)準(zhǔn)手冊的混合試劑盒進行。在StepOnePlus實時PCR系統(tǒng)上，采用通用SYBR進行定量PCR。以GAPDH作為內(nèi)參基因，引物序列：Sox2(F:GAACGCCTTCATGGTATGG;R:TCTCGGTCTCGGA CAAAAGT);Oct4(F:AGCTGCTGAAGCAGAAGAG G;R:AGATGGTGGTCTGGCTGAAC);Nanog(F:AAGGCAGCCCTGATTCTTCT;R:ACAGTCCGCATCT TCTGCTT);GAPDH(F: AACTTTGGCATTGTGGAAG G;R:GGATGCAGGGATGATGTTCT)。

1.2.5增殖和細(xì)胞周期分析 細(xì)胞增殖率采用CCK-8方法檢測，將轉(zhuǎn)染miR-26b模擬物和陰性對照物后1、2、3、4 d的細(xì)胞加入培養(yǎng)板中培養(yǎng)。再向培養(yǎng)板每孔加入CCK-8溶液。用酶標(biāo)儀測定在450 nm處的吸光度并計算細(xì)胞增殖率。采用碘化丙啶染色法測定細(xì)胞周期，用冰冷PBS沖洗mESCs細(xì)胞，加入預(yù)冷乙醇后離心，再重懸并加入PI染色液流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期。

1.2.6凋亡試驗 采用Annexin V/碘化丙啶(PI)染色檢測細(xì)胞凋亡。轉(zhuǎn)染72 h后，收集5×105個細(xì)胞，用冰冷PBS沖洗2次。然后，根據(jù)制造商說明書，用Alexa Fluor 488 Annexin V/Dead cell凋亡試劑盒和Alexa Fluor 488 Annexin V凋亡試劑盒和PI進行流式細(xì)胞術(shù)染色。未處理細(xì)胞作為雙重染色陰性對照。

1.2.7堿性磷酸酶染色 堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性檢測采用藍色AP染色試劑盒，依據(jù)正常步驟進行。

1.2.8蛋白免疫印跡法 將細(xì)胞培養(yǎng)至80%左右的密度，用PBS洗滌細(xì)胞2次，加入蛋白裂解緩沖液，冰上裂解30 min。將細(xì)胞刮下，12 000 r/min離心15 min，取上清液，采用BCA法對蛋白進行定量。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5%的脫脂牛奶封閉2 h，用抗體Sox2(1 ∶2 000)、Otc4 (1 ∶1 000)、Nanog(1 ∶1 000)，以α-Tubulin(1 ∶2 000)作為內(nèi)參對照。用適當(dāng)?shù)亩慰贵w(IgG/辣根酶標(biāo)記，1 ∶10 000)孵育后，用增強化學(xué)發(fā)光顯示信號。

2 結(jié)果

2.1 mESCs分化過程中miR-26b的內(nèi)源性表達課題組首先檢測了miR-26前體(pre-miR-26a-1、pre-miR-26a-2和pre-miR-26b)在不同時間點的mESCs(E14Tg2A細(xì)胞系)自發(fā)分化成胚狀體(EB)過程中的表達。在mESCs中，pre-miR-26b表達在miR-26簇群中占大多數(shù)(圖1)。小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(mouse embryonic fibroblast,MEF)中所有miR-26前體均上調(diào)，pre-miR-26b上調(diào)幅度最大(約10倍)(圖2)。成熟的miR-26b在胚狀體(EB)形成過程中第2～6天明顯上調(diào)(圖3)，成熟miR-26b在MEF中的表達水平明顯高于mESCs(圖4)。

圖1 實時熒光定量PCR檢測miR-26簇前體在mESCs中的表達

2.2 miR-26b對mESCs增殖的作用課題組利用miRNA mimics在mESCs中上調(diào)miR-26b的表達，表明miR-26b過表達能抑制mESCs增殖能力(圖5)，并顯示miR-26b過表達誘導(dǎo)mESCs阻滯于細(xì)胞周期的G1期(圖6)。然而，miR-26b并不影響mESCs的細(xì)胞凋亡(圖7)。

圖2 實時熒光定量PCR檢測miR-26簇前體在mESCs和MEF中的表達情況

圖3 擬胚體形成過程中miR-26b表達

圖4 實時熒光定量PCR比較miR-26b在mESCs與MEF中的表達

2.3 miR-26b對mESCs自我更新的作用通過堿性磷酸酶(ALP)染色檢測miR-26b在調(diào)節(jié)mESCs多能性中的作用。ALP染色結(jié)果表明miR-26b導(dǎo)致mESCs中ALP活性下降(圖8)，顯示miR-26b抑制了mESCs的多能性。誘導(dǎo)6 d后，過表達miR-26b的mESCs中多能性標(biāo)志物(Oct4、Sox2和Nanog)的表達水平均降低(圖9、10)。

圖5 miR-26b對mESCs增殖的影響

圖6 miR-26b對mESCs細(xì)胞周期的影響

圖7 miR-26b對mESCs細(xì)胞凋亡的影響

圖8 使用ALP染色試劑盒檢測miR-26b對mESCs堿性磷酸酶活性的影響

圖9 實時熒光定量PCR檢測miR-26b對mESCs中多能性轉(zhuǎn)錄因子的mRNA表達的影響

圖10 蛋白質(zhì)印跡分析檢測miR-26b對mESCs中3個關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子蛋白表達

2.4 miR-26b對mESCs分化的作用為了進一步評價miR-26b在mESCs分化中的作用，該研究構(gòu)建了一條穩(wěn)定的miR-26b表達的mESCs細(xì)胞系(圖11)。用體外模型研究了miR-26b對mESCs分化的影響。在miR-26b誘導(dǎo)的第4天就觀察到了分化的細(xì)胞(圖12)，其中mESCs開始變平并從細(xì)胞群落邊緣分離。隨后，大多數(shù)細(xì)胞群落失去了典型的單型形態(tài)，形成了具有不同形態(tài)的三維結(jié)構(gòu)。

圖11 穩(wěn)定過表達miR-26b mESCs的構(gòu)建策略

圖12 pcDNA-pre-miR-26b mESCs在誘導(dǎo)G418 4 d或6 d后的代表性明亮場區(qū)域中細(xì)胞形態(tài)圖像 ×200

3 討論

該文研究了miR-26b對mESCs多能性的調(diào)控作用。miR-26家族共3個成員，即miR-26a-1、miR-26a-2及miR-26b。本研究選擇關(guān)注miR-26b是因為在mESCs中的miR-26b表達豐度最高，提示miR-26b是mESCs分化過程中miR-26家族的關(guān)鍵成員，并且會隨著mESCs的分化逐漸上升。本研究結(jié)果表明miR-26b對mESCs的調(diào)控作用主要表現(xiàn)在兩個方面：首先，mESCs中上調(diào)miR-26b就足以阻止自我更新的維持，miR-26b能顯著抑制mESCs的多能性及正常的體外增殖，主要表現(xiàn)在對ALP活性的抑制、對三個關(guān)鍵多能性轉(zhuǎn)錄因子Sox2、Oct4和Nanog表達的抑制以及對mESCs體外增殖能力的抑制。其中對增殖能力的抑制可能與miR-26b對細(xì)胞周期的擾亂作用相關(guān)。其次，miR-26b具有促進mESCs的自發(fā)分化作用。本研究構(gòu)建了一條miR-26b穩(wěn)定過表達的mESCs細(xì)胞株，與對照組相比，此細(xì)胞株表現(xiàn)出了明顯的自發(fā)分化的傾向，這提示miR-26b能促進mESCs的自發(fā)分化。

近年來的一系列研究[2-4]闡明了miR-26家族在個體發(fā)育中的多種作用，包括miR-26在肌生成、成骨分化、胰腺細(xì)胞分化和肌肉分化等分化過程中的關(guān)鍵作用。結(jié)合本課題的研究結(jié)果，一個有趣的共同點是所有上述分化的組織或器官是從兩個胚層(中胚層和內(nèi)胚層)分化而來的。有研究[5]表明中胚層譜系的中胚層或內(nèi)胚層的形成是分化成中胚層衍生組織或器官的關(guān)鍵步驟。因此，需要進一步探索miR-26b如何通過對內(nèi)胚層和中胚層靶標(biāo)調(diào)控從而激活內(nèi)胚層譜系發(fā)育，尤其是miR-26b對內(nèi)胚層譜系成體細(xì)胞和組織器官中的作用和機制。本研究結(jié)果有助于更好地理解microRNA在mESCs多能性及分化中的作用，有助于闡明如何控制ESCs向特定治療細(xì)胞類型的分化，從而為潛在的細(xì)胞治療提供新策略和新途徑。