王向濤， 張 超， 廖李榮3,， 王 杰， 喻嵐輝3,， 張憲洲

(1.西藏農(nóng)牧學院 動物科學學院, 西藏 林芝 860000； 2.中國科學院 地理科學與資源研究所，生態(tài)系統(tǒng)網(wǎng)絡觀測與模擬重點實驗室， 拉薩高原生態(tài)試驗站， 北京 100101; 3.中國科學院大學， 北京 100049;4.西北農(nóng)林科技大學 水土保持研究所， 陜西 楊凌 712100; 5.中國科學院大學 資源與環(huán)境學院， 北京 100190)

目前，對于青藏高原高寒草甸生態(tài)系統(tǒng)已開展了大量研究，如植物群落的演替[7]、土壤養(yǎng)分[8]以及微生物量[9]、酶活性[10]的變化，而對于土壤參與氮素轉化的微生物研究相對較少，而這是深刻認識草地退化的關鍵科學問題。鑒于此，本研究以青藏高原不同退化程度的高寒草甸為對象，分析退化過程中土壤氮素轉化微生物基因豐度的變化，明確其影響因素，為退化高寒草甸的科學治理和人工恢復提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

研究區(qū)位于西藏自治區(qū)拉薩市當雄縣草原站(91°05′E，30°51′N)，海拔高度4 330 m，年均溫為1.3 ℃，最高月(7月)平均溫度為10.7 ℃，最低月(1月)平均溫度為10.4 ℃。年平均降水量為476 mm，集中在6—8月之間。草地類型為高寒草甸，優(yōu)勢種為高山嵩草(Kobresiapygmaea)，常見伴生種有窄葉苔草(Carexmontis-everestii)、絲穎針茅(Stipacapillacea)、二裂葉委陵菜(Potentillabifurca)和釘柱委陵菜(Potentillasaundersiana)等。土壤類型為典型的高山草甸土。

1.2 樣品采集

根據(jù)草地植物種類及蓋度的差異，參照Xue等[11]對天然草地退化等級劃分標準，設定為未退化(non-degraded， ND)，輕度退化(light degraded， LD)，中度退化(moderate degraded， MD)以及重度退化(severe degraded， SD)4種退化草地處理。每個小區(qū)面積為40 m×60 m，每個處理5個重復。于2018年8月采集樣品，采用蛇形取樣法，每個小區(qū)沿150 m的樣條建立了5個等間距的采樣點(0.5 m×0.5 m)，以內徑為3.5 cm 的土鉆，采集0—20 cm 土樣，每樣地取樣5～8個，混為1個土樣。土壤樣本去除枯落物及植物根系后，分為兩個部分，一部分過篩風干進行理化性質的測定分析，另一部分保存在-80 ℃用于進行DNA的提取。

1.3 土壤理化性質測定

1.4 土壤微生物功能基因豐度測定

微生物功能基因豐度采用定量PCR測定。本研究中主要測定了參與土壤氮素轉化的7個基因，包括nifH,amoA-AOA,amoA-AOB,narG,nirK,nirS以及nosZ，其功能見表1，測定方法參考廖李容等[13]，即取0.25 g凍干樣品，按照UltraClean soil DNA Extraction Kit試劑盒的說明書，提取土壤總DNA，目的基因引物序列見表1，擴增程序為98 ℃，持續(xù)60 s；30個循環(huán)，98 ℃，10 s；50 ℃，30 s；72 ℃，30 s；在72 ℃下保持5 min，每個樣品重復3次，使用ABI 7500實時PCR系統(tǒng)測定濃度。

表1 氮轉化微生物功能基因PCR擴增引物及對應功能[13]

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用單因素方差分析對不同退化程度草地的土壤理化性質及功能基因進行差異分析，并使用最小顯著性差異法對不同退化草地之間的差異進行多重比較，顯著水平為0.05。采用Pearson法和冗余分析 (RDA)，分析氮轉化基因與土壤性質之間的關系。所有統(tǒng)計分析采用R的vegan包，利用SigmaPlot 12.0作圖。圖中數(shù)據(jù)為平均值±標準差。

2 結果與分析

2.1 土壤理化性質

高寒草甸退化顯著影響土壤理化性質(見表2)。與未退化草甸相比，退化草甸的土壤有機碳、全氮、硝態(tài)氮和銨態(tài)氮含量均顯著降低(p<0.05)，降幅分別達41.9%～67.5%，26.8%～56.2%，44.7%～76.6%和36.0%～58.9%。輕度退化草甸的速效磷及速效鉀含量與未退化草甸相比無顯著差異(p>0.05)，顯著高于中度和重度退化草甸(p<0.05)。土壤pH值變化為6.43～6.90，且隨退化程度的增高而逐漸增加。退化降低了土壤水分，其含量隨退化程度的增高而逐漸下降，與未退化草甸相比，重度退化草甸的水分含量降低了33.6%。

表2 不同退化草地土壤理化性質

2.2 土壤氮素轉化相關基因

由表3可以看出，不同退化程度草甸的土壤氮素轉化微生物基因豐度差異顯著。其中，nifH基因的豐度變幅最大(每g干土6.88×103～2.76×109個拷貝數(shù))，且隨退化程度的加劇而逐漸下降，與未退化草甸相比，重度退化草甸的nifH基因豐度降低了78.1%。amoA-AOA和amoA-AOB基因豐度分別為5.24×103～3.06×109和7.02×103～2.96×109個拷貝數(shù)，兩者變化趨勢相同，均隨退化程度顯著降低(p<0.05)，中度退化和重度退化草甸的土壤amoA-AOA基因豐度無明顯差異(p>0.05)，但均顯著低于未退化和輕度退化草甸。nirK和nirS基因變化趨勢與nifH相反，隨退化程度的加劇而增加，重度退化草甸的nirK和nirS豐度最高，顯著高于未退化草甸(p<0.05)。輕度退化和中度退化草甸土壤中narG基因豐度與未退化草甸無顯著差異，但顯著低于重度退化草甸(p<0.05)。不同退化草甸之間nosZ基因豐度無顯著差異(p>0.05)。

表3 不同退化草地土壤氮轉化微生物功能基因豐度

2.3 氮素轉化微生物基因與土壤理化性質的相關性

相關性分析表明(見表4)，nifH基因與土壤pH值呈極顯著負相關(p<0.01)，與水分、有機碳、硝態(tài)氮、銨態(tài)氮及速效鉀呈顯著正相關(p<0.05)。

由表4可知，amoA-AOA和amoA-AOB基因豐度與土壤含水量的相關性最大，相關系數(shù)分別為0.76和0.81。nirK和nirS基因與pH值呈顯著正相關(p<0.05)，而與土壤含水量、有機碳、硝態(tài)氮、銨態(tài)氮和全磷呈顯著負相關。narG則與銨態(tài)氮呈顯著正相關。

表4 土壤理化性質與氮素轉化微生物基因豐度的相關性

RDA分析表明(見圖1)，土壤理化特性解釋了53.2%氮轉化功能基因豐度變異，其中第1軸解釋率為52.7%，第2軸解釋率為10.5%。土壤有機碳，pH值和含水量是影響高寒草甸土壤氮素微生物基因的主要因素。其中，有機碳和pH對nifH基因變化的影響較大，含水量對amoA-AOA和amoA-AOB基因影響較大，pH值對nirK和nirS基因影響較大。

注：OC為有機碳; TN為全氮;為銨態(tài)氮;為硝態(tài)氮; AP為速效磷; AK為速效鉀; WC為含水量; 虛線箭頭線為微生物基因豐度; 實線箭頭線為土壤理化特征。

3 討 論

在土壤—植被體系中，土壤制約植被，尤其是土壤養(yǎng)分會引起植物群落結構及物種多樣性的改變[14]。近年來，由于超載放牧等人為干擾及氣候變化異常等多重因素的影響，草地沙化、黑土灘化、植被稀疏化等植被和土壤退化過程不斷加劇，高寒草地生態(tài)功能嚴重受損。本研究表明，隨著退化程度的加劇，土壤有機碳、全氮、銨態(tài)氮和硝態(tài)氮含量均顯著降低，這與王玉琴等[15]、郭小偉等[16]等研究結果一致，其原因與地上生物量的減少密切相關。高寒草甸退化導致生物量減少，枯落物也相應減少，導致輸入到土壤中的有機質下降，土壤中的碳氮主要來源于有機質，因此土壤中的碳氮含量顯著降低。前人研究表明，植被覆蓋度與土壤含水量呈顯著負相關關系[17-18]。植物蓋度降低必然導致土壤裸露面積增大，引起地表蒸發(fā)量增大，進而導致含水量降低以及土壤pH值增加，因此在本研究中，土壤含水量隨退化程度加劇顯著降低，而pH值則顯著增加，這與高海寧等[19]研究結果一致。王玉琴等[15]發(fā)現(xiàn)，高寒草甸在退化過程中，土壤銨態(tài)氮和硝態(tài)氮的含量逐漸增加，推測其原因是嚙齒動物排泄物的增加，導致速效氮含量增加。然而，我們發(fā)現(xiàn)土壤銨態(tài)氮和硝態(tài)氮隨草甸退化程度的加劇而顯著降低，與王玉琴等[15]結果相反。由于氮素的轉化易受環(huán)境條件的影響，因此這種結果差異可能與不同草地類型以及人為或動物的干擾程度有關。磷、鉀是植物生長所必需的營養(yǎng)元素，在植物生命活動中發(fā)揮著重要作用[20]。本研究中，隨著退化程度的加劇，土壤速效磷、速效鉀均呈降低趨勢。造成這一現(xiàn)象的原因是退化草地中土壤微生物減少，使得植物殘體的分解速率降低，導致土壤中速效磷和速效鉀含量降低。

4 結 論

青藏高原高寒草甸退化導致土壤有機碳、全氮、硝態(tài)氮、銨態(tài)氮及水分含量降低及pH值升高。高寒草甸的退化降低了固氮nifH基因、氨氧化amoA-AOA和amoA-AOB基因豐度，但增加了反硝化narG,nirS和nirK基因豐度。土壤有機碳，pH值及水分是影響高寒草甸土壤氮素轉化微生物基因的主要因素。