李明蔚，郭龍軍，石照蓉，吳 洋，陳建飛，時洪艷，馮 力

（中國農業(yè)科學院 哈爾濱獸醫(yī)研究所，黑龍江 哈爾濱 150069）

豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV），屬于冠狀病毒科，α冠狀病毒屬，是導致仔豬及斷奶仔豬腹瀉的重要病原之一[1-2]。病毒感染能夠誘導機體產生先天性免疫應答，產生I 型干擾素（IFN-I 或IFN-α/β），在清除病毒感染及誘導機體產生被動免疫過程中發(fā)揮重要作用。I 型干擾素作為重要的細胞因子，誘導干擾素刺激基因的表達（IFN-stimulated gens，ISGs），使機體呈現(xiàn)抗病毒狀態(tài)[3-4]。為遏制機體先天免疫應答信號的傳遞，阻止宿主細胞抗病毒相應分子的激活，減少或者抑制干擾素的產生，很多病毒（包括冠狀病毒）已經進化形成不同的策略應對宿主細胞的先天性免疫應答反應[5-10]。FBXW7 是SCF（Skp1、Cul-1、Rbx1 和F-box蛋白復合物）型E3 泛素連接酶復合物的組成蛋白，F(xiàn)BXW7 能夠識別并特異性結合相關底物，通過促進底物泛素化降解底物蛋白，目前FBXW7 蛋白在細胞增殖分化、腫瘤發(fā)生及轉移等方面發(fā)揮重要作用。然而FBXW7 對病毒感染的調節(jié)作用鮮有報道，本研究我們發(fā)現(xiàn)PEDV 感染能夠下調宿主細胞FBXW7 的表達，過表達FBXW7 能夠抑制PEDV 復制，PEDV感染條件下FBXW7 能明顯促進宿主細胞的抗病毒天然免疫反應。基于PEDV 感染能夠減少FBXW7 的表達，因此PEDV 通過減少宿主細胞FBXW7 的表達從而拮抗宿主抗病毒天然免疫應答，進而利于病毒自身感染復制。本研究揭示了一種PEDV 逃逸宿主天然免疫應答的新策略，為更好闡明PEDV 的致病機制提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料Vero E6 和IPEC-J2 細胞由本實驗室保存。RNA 提取試劑盒購自Qiagen 公司；反轉錄試劑盒和細胞裂解液購自?；锟萍加邢薰荆籗YBR 熒光定量試劑盒購自Takara 公司；DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清購自Gibco 公司；轉染試劑購自Roche 公 司； anti-mouse IgG 及anti-rabbit IgG 購 自Abbkine 公 司；anti-FBXW7 購 自Abcam 公 司；anti-HA 購自sigma 公司；鼠抗PEDV N 蛋白的抗體由本實驗室自制。

1.2 病毒感染試驗在顯微鏡下觀察，待Vero E6細胞長到90%左右時，進行傳代培養(yǎng)，根據所需濃度接種到細胞平板中，放入37 ℃溫箱培養(yǎng)，當細胞形成單層時，用PEDV（MOI 0.1）進行接毒感染，接毒后不同時間點收集細胞樣品進行western blot 鑒定。

1.3 細胞轉染將適宜濃度的Vero E6 細胞接種到12 孔板中，于37 ℃，5% CO2常規(guī)過夜培養(yǎng)，按照轉染試劑說明，將1 μg 的pCAGGS-HA-FBXW7 和pCAGGS-HA 轉染Vero E6 細胞，轉染后24 h 進行PEDV 感染試驗（MOI 0.1），感染后24 h 和36 h 收集細胞。

1.4 細胞因子SYBR Green I 熒光定量PCR（Quantitative real-time PCR）檢測IPEC-J2 細胞接種到12 孔板中，37 ℃，5%CO2常規(guī)過夜培養(yǎng)，按照轉染試 劑 說 明 將 1 μg 的 pCAGGS-HA-FBXW7 和pCAGGS-HA 分別轉染IPEC-J2 細胞，轉染后24 h 進行PEDV 感染（MOI 0.1），感染后24 h 收集細胞樣品。常規(guī)方法提取細胞樣品RNA 并進行cDNA 轉錄，利用TaKaRa 熒光定量試劑盒檢測宿主細胞IFN-β、ISG15、ISG54 和ISG56 的轉錄水平。

2 結果與討論

2.1 PEDV 感染下調FBXW7 表達Vero E6 細胞感染PEDV 后不同時間（24 h，36 h 和48 h）收集細胞樣品并進行細胞裂解，通過western blot 方法檢測細胞內源性FBXW7 的表達。結果顯示，PEDV 感染后36 h 和48 h，PEDV 感染組的FBXW7 蛋白表達水平明顯低于對照組（圖1），說明PEDV 感染能夠顯著下調Vero E6 細胞FBXW7 的蛋白表達。本研究首次揭示PEDV 感染對FBXW7 蛋白表達的抑制作用。

圖1 PEDV 感染下調FBXW7 的表達Fig.1 Reduction of FBXW7 expressions was induced by PEDV infection

2.2 FBXW7 抑制PEDV 感染復制已有研究報道，F(xiàn)BXW7 為SCF E3 泛素連接酶復合物的蛋白之一，F(xiàn)BXW7 能夠特異性識別底物蛋白，通過泛素蛋白酶體途徑降解靶蛋白，調節(jié)腫瘤和癌癥等疾病的發(fā)生和發(fā)展[11]。為研究FBXW7 在PEDV 感染中的作用，本研究將pCAGGS-HA-FBXW7 轉染Vero E6 細胞，轉染24 h 后接種PEDV，在感染后24 h 和36 h 分別收集細胞樣品并進行細胞裂解處理，通過western blot 方法檢測重組FBXW7 的表達及其對PEDV 感染復制的作用。結果顯示，重組FBXW7 蛋白正確表達；與對照組相比，過表達FBXW7 能夠明顯抑制PEDV N蛋白的表達水平（圖2），表明重組FBXW7 能夠負調控PEDV 的復制，在宿主細胞抗病毒天然免疫應答過程中發(fā)揮重要作用。

圖2 過表達FBXW7 抑制PEDV 復制Fig.2 PEDV replication was inhibited by overexpressions of FBXW7

2.3 PEDV 感染條件下FBXW7 能夠促進IFN-β及ISGs 因子的轉錄水平 病毒感染可誘導宿主細胞產生干擾素及ISGs，從而使宿主細胞呈現(xiàn)抗病毒狀態(tài)，發(fā)揮天然免疫應答反應。Vero E6 為PEDV 體外分離及傳代常用的細胞系，對PEDV 易感；IPEC-J2為PEDV 體內感染的靶細胞，然而體外實驗表明IPEC-J2 細胞系對PEDV 不敏感，感染效率顯著低于Vero E6 細胞。此外，鑒于Vero E6 為IFN 缺陷型細胞，因此為研究FBXW7 在PEDV 感染過程中對IFN-β及ISGs 的調節(jié)作用，本研究選用IPEC-J2 細胞為感染模型。首先將FBXW7 的重組質粒轉染IPEC-J2 細胞，在轉染后24 h 進行PEDV 接種感染試驗，接毒后24 h 收集細胞，通過熒光定量方法檢測過 表 達FBXW7 對IPEC-J2 細 胞IFN-β、ISG15、ISG54 和ISG56 轉錄水平的影響。結果顯示，與對照組相比，F(xiàn)BXW7 過表達組IPEC-J2 細胞IFN-β、ISG15、ISG54 和ISG 56 轉錄水平顯著增高（p<0.05）（圖3），表明在PEDV 感染條件下FBXW7 能夠促進宿主細胞IFN-β、ISG15、 ISG54 和ISG56 的轉錄，能夠促進宿主細胞產生更好的抗病毒天然免疫應答，利于抑制PEDV 感染。

宿主先天性免疫系統(tǒng)形成了通過產生IFN 以及各種其他細胞因子來抑制病毒感染的第一道防線。大多數病毒感染后病毒的病原體相關分子模式被細胞的相關受體識別并進行信號轉導，啟動I 型IFN的快速產生，進而誘導ISGs 表達并發(fā)揮抗病毒作用，因此I 型IFN 是在病毒生命周期的任何階段防御病毒感染的重要介體[12]。然而，病毒在進化過程中產生一系列策略拮抗宿主細胞天然免疫應答反應，如下調重要受體及節(jié)點分子的轉錄水平、降解信號通路中重要的節(jié)點分子、病毒感染復制產物與節(jié)點分子競爭性結合等[13]。本研究表明FBXW7 為宿主天然免疫應答正調控因子，能夠抑制PEDV 感染復制，并能夠促進宿主細胞IFN 及ISGs 的轉錄。PEDV在感染過程中能夠有效抑制FBXW7 的表達，從而抑制宿主細胞天然免疫抗病毒應答反應，利于PEDV自身感染復制。本研究揭示了PEDV 拮抗宿主抗病毒應答的新策略，為PEDV 致病機制研究提供理論基礎。

圖3 FBXW7 促進IFN-β和ISGs 的轉錄Fig.3 FBXW7 facilitated the transcriptions of IFN-β and ISGs