朱 沛，李占鴻，謝佳芮，牛保生，姚萍芬，朱建波，肖 雷*，李華春*

（1. 云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院 云南省熱帶亞熱帶動物病毒病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650224；2. 云南省師宗縣動物疫病控制中心，云南 師宗 655700）

藍(lán)舌?。˙T）是由呼腸孤類病毒科環(huán)狀病毒屬的藍(lán)舌病病毒（BTV）引起的非接觸性蟲媒病毒病[1-2]，BTV 為雙鏈RNA 病毒，基因組大小約為20 kb，由Segment1（Seg-1）～Segment10（Seg-10）10 個 節(jié) 段 組成，可編碼7 種結(jié)構(gòu)蛋白（VP1～VP7）和5 種非結(jié)構(gòu)蛋白（NS1～NS3、NS3a、NS4）[3]，其中VP7 是BTV 內(nèi)衣殼的結(jié)構(gòu)蛋白[4]，決定了BTV 的群特異性，不同血清型BTV 的VP7 蛋白氨基酸序列的相似度可達(dá)94%以上[5]；而VP2 由L2 基因編碼，在不同血清型的病毒之間保守性最低，其氨基酸序列在不同血清型病毒株間的差異在22.7%（BTV-4 與BTV-20）至72.9%（BTV-6與BTV-22）[6]，VP2 是誘導(dǎo)BTV 產(chǎn)生特異性中和抗體的主要蛋白，決定了BTV 的血清型，迄今全球已確認(rèn)的血清型共有27 個（BTV1～BTV27）[7-9]。

動物感染BT 后表現(xiàn)為發(fā)熱、黏膜水腫、鼻腔及胃腸黏膜嚴(yán)重卡他性炎癥，伴隨舌頭發(fā)紺，以綿羊和牛最易感，動物感染BTV 的平均死亡率為30%，綿羊高達(dá)80%[10]，該病對牛羊養(yǎng)殖業(yè)造成的經(jīng)濟(jì)損失嚴(yán)重，據(jù)估計全球每年僅因BT 而導(dǎo)致的經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)30 億美元[11]，BTV 血清型眾多，不同血清型之間交叉保護(hù)弱，給BT 的防控帶來了嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)，該病目前沒有很好的預(yù)防辦法，世界動物衛(wèi)生組織（OIE）將BT 列為法定報告的動物疫病，我國將其列為一類動物疫病。自1979 年張念祖等人首次從云南分離到BTV 后，全國范圍內(nèi)陸續(xù)分離到7 個血清型的BTV（BTV-1、-2、-3、-4、-12、-15、-16），此外2012年肖雷等從云南省師宗縣牛血液中分離到一株BTV-5[12]，2013 年李占鴻等從云南省芒市分離到一株BTV-9，2014年呂敏娜等從廣東省牛血液中分離一株BTV-7[13]，雖然前期血清學(xué)調(diào)查顯示中國部分地區(qū)存在BTV-2 的流行，但甚少有BTV-2的分離報道，本實(shí)驗(yàn)室從2017 年6 月師宗縣牛的抗凝血中分離到一株BTV-2，并對分離株的Seg-2及Seg-7序列的遺傳特性進(jìn)行分析，為開展BTV-2 在中國的流行趨勢、遺傳特性以及致病性的深入研究奠定了良好基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 監(jiān)控點(diǎn)及樣品采集從氣候條件、海拔高度等因素綜合考量，選擇云南省師宗縣、江城縣及芒市鎮(zhèn)作為監(jiān)控點(diǎn)，采取競爭ELISA 方法檢測牛羊BTV 抗體情況，篩選BTV 抗體陰性的10 頭牛和5 只羊作為哨兵動物，每年5 月至10 月每周采血一次，11 月至次年4 月每月采血一次。每次采集一份無抗凝劑全血和一份肝素鈉抗凝血，并及時送至實(shí)驗(yàn)室開展病毒檢測及分離工作。

1.2 主要試劑BTV 競爭ELISA（C-ELISA）抗體檢測試劑盒、倉鼠腎細(xì)胞（BHK-21）、蚊子細(xì)胞（C6/36）、BTV 標(biāo)準(zhǔn)株及其標(biāo)準(zhǔn)血清均由云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院熱帶亞熱帶動物病毒病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供；E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞、DNA 膠回收試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；病毒RNA 提取試劑盒、PrimeScript One Step RT-PCR 試劑盒、pMD18-T載體、DNA Marker 均購自TaKaRa 公司。

1.3 哨兵動物血清BTV 抗體檢測參照BTV C-ELISA 抗體檢測試劑盒說明書檢測2017 年監(jiān)控動物血清樣品共1350 份。

1.4 哨兵動物血液BTV 的檢測取哨兵動物BTV抗體轉(zhuǎn)陽時間點(diǎn)前后兩周的抗凝血200 μL，用1 mL滅菌PBS 洗滌3 次后，離心棄上清，1 mL 超純水使紅細(xì)胞裂解，按病毒RNA 提取試劑盒說明書提取病毒總RNA，RNA 經(jīng)95 ℃變性5min 后，以其作為PCR 檢測的模板。針對BTV 最保守的VP7 設(shè)計引物，BTV-S7-F：5'-GTAAGTGTAATCTAAGAGA-3'；BTV-S7-R：5'-GTAAGTTTAAATCGCAAGACG-3'，引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。RT-PCR 反應(yīng)條件為：45 ℃40 min，94 ℃2 min；94 ℃30 s、55 ℃30 s、72 ℃60 s，40 個循環(huán)，PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測；并以本實(shí)驗(yàn)室建立的BTV 高通量Real-Time qRT-PCR 方法進(jìn)行BTV 核酸檢測。

1.5 病毒分離與電鏡觀察取核酸檢測為BTV 陽性的抗凝血紅細(xì)胞200 μL，靜脈接種于10 日齡健康雞胚中，每枚雞胚接種0.1 mL，37 ℃孵化箱培養(yǎng)，廢棄24 h 內(nèi)死亡的雞胚，收集24 h～120 h 死亡的雞胚肝臟，加入1 mL 滅菌MEM 研磨，取200 μL 接種于25 cm2的C6/36 細(xì)胞培養(yǎng)瓶里，37 ℃培養(yǎng)6 d 后，取1 mL 培養(yǎng)液上清在BHK-21 上繼續(xù)盲傳3 代，當(dāng)出現(xiàn)細(xì)胞病變（CPE）時，收獲細(xì)胞上清，超速離心后取沉淀，用PBS 溶解過夜后滴加于銅網(wǎng)上，使用磷鎢酸進(jìn)行負(fù)染，在電鏡下觀察病毒粒子的形態(tài)，并參照文獻(xiàn)方法對分離到的病毒進(jìn)行TCID50的測定[14]。

1.6 病毒的群特異性鑒定按照1.4 中的方法特異性擴(kuò)增1.5 中BTV 分離株的Seg-7 序列，對BTV 的群特異性進(jìn)行鑒定。

1.7 病毒的血清型鑒定VP2決定BTV的血清型，擴(kuò)增1.5 中分離病毒的Seg-2 序列，50 ℃30 min，94 ℃2 min；94 ℃30 s、56 ℃30 s、72 ℃90 s，40 個循環(huán)，PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收后，連接pMD18-T載體，并轉(zhuǎn)化于E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，重組菌株經(jīng)PCR 鑒定后，由昆明碩擎生物科技有限公司測序，通過MEGA 6 軟件對分離病毒株的Seg-2 序列與GenBank 部分病毒株Seg-2 標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行比對并構(gòu)建進(jìn)化樹。

1.8 微量中和試驗(yàn)由于Seg-2 編碼的VP2 在同一血清型中仍存在較大差異[6]，因此根據(jù)血清型設(shè)計的引物往往無法對同一型的所有BTV 進(jìn)行有效擴(kuò)增，而BTV 血清型之間缺乏交叉保護(hù)，所以中和試驗(yàn)一直作為經(jīng)典的型鑒定方法在使用。為進(jìn)一步明確分離病毒株的血清型，本研究分別進(jìn)行了分離株與BTV 標(biāo)準(zhǔn)血清的微量中和試驗(yàn)和分離株對應(yīng)血清與BTV 標(biāo)準(zhǔn)病毒的微量中和試驗(yàn)，通過血清學(xué)試驗(yàn)進(jìn)一步鑒定分離株的血清型。

2 結(jié) 果

2.1 哨兵動物血清BTV 抗體檢測通過C-ELISA方法檢測2017 年全年的監(jiān)控群血清，結(jié)果顯示6 月27 日師宗縣哨兵動物2 號牛BTV 抗體轉(zhuǎn)陽。

2.2 哨兵動物血液BTV 的檢測提取哨兵動物紅細(xì)胞RNA，經(jīng)RT-PCR 檢測結(jié)果顯示，2 號牛轉(zhuǎn)陽當(dāng)周及前后一周的核酸均為陽性，提示其中可能含有BTV，傳代后取上清，qRT-PCR 結(jié)果顯示轉(zhuǎn)陽前一周抗凝血的Ct 值最小，提示其中病毒含量最高，分離到BTV 的可能性最大（表1）。

表1 監(jiān)控動物BTV ELISA 及qRT-PCR 結(jié)果Table 1 BTV ELISA and quantitative real-time PCR results of the Monitoring animals

2.3 病毒分離與電鏡觀察核酸檢測為BTV 陽性的抗凝血樣品經(jīng)靜脈接種雞胚后，雞胚出現(xiàn)死亡，剖解后發(fā)現(xiàn)雞胚全身出血，收集死亡雞胚肝臟，研磨后接種C6/36 細(xì)胞，培養(yǎng)6 d 后取上清1 mL 接種于BHK-21 細(xì)胞，盲傳到第3 代時，細(xì)胞出現(xiàn)明顯CPE，出現(xiàn)皺縮，崩解，脫落，qRT-PCR 檢測結(jié)果為BTV 陽性（Ct 值19.2）。表明分離到的病毒株為BTV，命名為YN/SZ/22457，在電鏡下觀察病毒呈球形無囊膜，直徑約為70 nm，病毒粒子表面分布有大量的纖維狀突起（圖1），參照文獻(xiàn)方法[14]，測定該病毒的效價為10-4.88TCID50/50 μL。

2.4 Seg-2 與Seg-7 基因擴(kuò)增及序列分析分別擴(kuò)增分離株YN/SZ/22457 的Seg-2 及Seg-7 序列，結(jié)果顯示，分別在2 237 bp和1 093 bp處有目的條帶（圖2），片段大小符合預(yù)期，進(jìn)一步表明該分離株為BTV。分離株Seg-2 及Seg-7 序列測序后進(jìn)行比對并構(gòu)建進(jìn)化樹，結(jié)果顯示分離株YN/SZ/22457 的Seg-2 序列和日本病毒株BTV-2（AB686224）以及臺灣病毒株BTV-2（AY493687）的Seg-2 序列相似度較高，且位于同一分支上（圖3），表明分離株為BTV-2 型；分離株YN/SZ/22457 的Seg-7 序列與與臺灣病毒株BTV-2（AY493692）以及日本病毒株BTV-21（AB473807）親緣關(guān)系最近，同為Eastern 2 型（圖4）。

2.5 微量中和試驗(yàn)本研究在BHK 細(xì)胞進(jìn)行YN/SZ/22457 對應(yīng)血清與27 個型BTV 標(biāo)準(zhǔn)病毒的微量中和試驗(yàn)，結(jié)果顯示經(jīng)1:10 稀釋后，YN/SZ/22457 對應(yīng)血清對BTV-2、BTV-22、BTV-23 的100 TCID50存在保護(hù)，進(jìn)一步稀釋結(jié)果顯示，當(dāng)1:40 稀釋時，YN/SZ/22457 對 應(yīng) 血 清 對BTV-22、BTV-23 不 再 保護(hù)，而當(dāng)1:160 稀釋時，仍對BTV-2 型標(biāo)準(zhǔn)毒有保護(hù)作用；同時，本研究用100 TCID50的YN/SZ/22457與BTV-2、BTV-22、BTV-23 標(biāo)準(zhǔn)血清進(jìn)行微量中和試驗(yàn)，結(jié)果顯示YN/SZ/22457 僅對BTV-2 型標(biāo)準(zhǔn)血清存在中和作用，中和效價為1:80，進(jìn)一步從血清學(xué)上驗(yàn)證了分離株YN/SZ/22457 為BTV-2 型。

圖1 BTV 分離株YN/SZ/22457 的電鏡觀察Fig.1 Electron microscopic observation of isolated BTV strain YN/SZ/22457

圖2 YN/SZ/22457 的RT-PCR 鑒定Fig.2 Identification of YN/SZ/22457 by RT-PCR

圖3 YN/SZ/22457 株Seg-2 基因序列系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.3 Phylogenetic analysis based on the Seg-2 sequences of the YN/SZ/22457 strain

圖4 YN/SZ/22457 株Seg-7 基因序列系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.4 Phylogenetic analysis based on the Seg-7 sequences of the YN/SZ/22457 strain

3 討 論

BTV 是一種蟲媒病毒，它的傳播需要病原、媒介以及宿主，由于BTV 初次分離株在細(xì)胞培養(yǎng)上不敏感，因此選擇雞胚靜脈接種的方式接種哨兵動物抗凝血，在前期研究發(fā)現(xiàn)BTV 在蚊子細(xì)胞（C6/36）中能快速增殖但不產(chǎn)生明顯病變，因此本研究采用“雞胚-C6/36 細(xì)胞-BHK-21 細(xì)胞”接種方式，以高效分離病毒，最終從2017 年師宗縣BTV 抗體陽性的?？鼓蟹蛛x到一株BTV-2，此外本實(shí)驗(yàn)室通過建立監(jiān)控點(diǎn)，并對哨兵動物定期采血的方式在云南省多個地區(qū)成功分離到多株蟲媒病毒，該方法對其他病毒的分離具有指導(dǎo)意義。

自1979 年，張念祖等首次從云南省師宗縣分離到BTV，2012 年肖雷等又從師宗縣分離到67 株BTV[15-16]，表明師宗縣為BTV 高發(fā)地區(qū)，在該地設(shè)立監(jiān)控點(diǎn)能夠提高BT 的自然感染幾率；從分離到的病毒株來看，當(dāng)?shù)谺TV-1 和BTV-16 為主流血清型，本研究于2017 年從師宗縣哨兵動物血液中分離到BTV-2，新血清型的出現(xiàn)提示了BT 的風(fēng)險，這可能和當(dāng)?shù)孛浇榈淖兓蛣游锏牧魍ㄓ嘘P(guān)；此前，BTV-2 曾在美國、澳大利亞及以色列分離到，2000年曾在北非流行，而我國甚少有BTV-2 型的報道。

BTV 基因組由Segment1～Segment10 這10 個節(jié)段組成[3]，本研究選擇Seg-2 編碼的VP2 以及Seg-7 編碼的VP7 進(jìn)行測序分析。VP2 決定了BTV 的血清型，對不同地域分離的同一血清型BTV 株的Seg-2序列分析表明，Seg-2 序列的變異在一定程度上體現(xiàn)著病毒的地域特征，并可據(jù)此將同一血清型病毒株分為Eastern 型與Western 型[17]。通過對分離株YN/SZ/22457 的Seg-2 序列做系統(tǒng)發(fā)生分析，分離株的Seg-2 序列和日本以及臺灣BTV-2 株的Seg-2 序列相似度最高，親緣關(guān)系最近，表明分離株為BTV-2型，也意味著流行于中國、日本、臺灣的BTV-2 株有著相同的起源，同為Eastern 型，但新出現(xiàn)的血清型來源還有待進(jìn)一步深入研究。研究對Seg-7 序列的進(jìn)化分析顯示，分離株YN/SZ/22457 的Seg-7 序列與臺灣株BTV-2（AY493692）以及日本病毒株BTV-21（AB473807）親緣關(guān)系最近，同東方型中的Eastern2亞型。

云南省地處中國西南邊陲，與周邊多個國家接壤，跨境動物傳播疫病的風(fēng)險大，同時覆蓋多種氣候環(huán)境，一些地區(qū)常年溫暖濕潤，給蟲媒病毒的媒介提供了滋養(yǎng)環(huán)境，所以云南省在蟲媒病毒防控及跨境動物疫病風(fēng)險控制方面面臨巨大挑戰(zhàn)，本研究首次報道了云南地區(qū)BTV-2 的分離鑒定，并分析了分離株Seg-2 和Seg-7 的序列特征，研究結(jié)果將為進(jìn)一步掌握云南省BTV 血清型的流行情況、致病性、遺傳特性奠定基礎(chǔ)，也將為全國范圍內(nèi)蟲媒病毒的監(jiān)測與防控工作提供重要參考。