孔桂慧，王方昆，孫淑紅，孟照潔，許明清，趙 情

（1. 山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院，山東 泰安 271018；2. 山東和康源生物育種股份有限公司，山東 濟(jì)南 250101）

鴨疫里默氏桿菌病是由鴨疫里默氏桿菌（Rimer?ella anatipestifer，RA）引起的一種接觸性傳染性疾病，又稱為鴨傳染性漿膜炎。該病多見于2～8 周齡雛鴨，成年鴨罕見發(fā)病，呈急性或慢性敗血癥，主要表現(xiàn)為精神沉郁，纖維素性心包炎、肝周炎，眼瞼流淚，還可引起干酪性輸卵管炎、腦膜炎、結(jié)膜炎和關(guān)節(jié)炎等[1]。RA 在自然界分布廣泛，血清型眾多，公認(rèn)的有21 種[2]，并且不同血清型之間無交叉免疫保護(hù)作用，再加上臨床治療抗生素的濫用，導(dǎo)致該病的防控和治療極其困難[3-4]。

近年來國內(nèi)多次報道RA 病例，且血清型多樣，臨床癥狀各有不同。李書光等在50 日齡種鴨分離到一株2 型RA，該菌對鴨群造成死亡率約為1%，可導(dǎo)致纖維素性心包炎、肝周炎、氣囊炎、腦部水腫[5]；焦哲等在湖北13 日齡雛蛋鴨中分離到一株RA，該菌與呼腸孤病毒出現(xiàn)混合感染，該鴨群表現(xiàn)為頭腫大流淚，腳軟，共濟(jì)失調(diào)，排白色稀便[6]；郝東敏等在13 日齡肉鴨中分離到一株7 型RA，該菌可導(dǎo)致鴨群周死淘率1.4%，剖檢病死鴨可見肝臟有纖維素膜附著，腦膜出血[7]。

2019 年7 月在山東某櫻桃谷種鴨場，存欄5 500只，29 周齡，出現(xiàn)不明原因死淘升高，每天死亡12只左右，周死淘率為1.53%。死亡鴨子料量減少、有神經(jīng)癥狀，現(xiàn)場剖檢癥狀為卵泡出血、破裂，纖維素性心包炎、肝周炎、肝臟腫大、出血，根據(jù)剖檢癥狀初步判定為細(xì)菌感染后，在腦中分離到1 株RA，并對其進(jìn)行血清型鑒定和毒力測定等，通過動物回歸實(shí)驗(yàn)最終確診該種鴨場大量成年種鴨突發(fā)死亡病因是1 型RA 感染。

1 材料與方法

1.1 病料樣品及實(shí)驗(yàn)動物病料樣品來自山東省某種鴨場29 周櫻桃谷發(fā)病種鴨，無菌采集發(fā)病鴨腦、肝臟、脾臟、卵泡等組織。7 日齡和28 日齡健康櫻桃谷商品鴨來自山東和康源生物育種股份有限公司。

1.2 主要試劑病毒RNA 提取試劑盒購自廣州飛揚(yáng)生物工程有限公司；RT-PCR 一步法試劑盒[HiS?cript ⅡOne Step RT-PCR Kit（Dye Plus）]購自南京諾唯贊生物科技有限公司；DL2000 DNA Maker 購自TaKaRa 公 司； 營 養(yǎng) 瓊 脂（NA）、 麥 康 凱 瓊 脂（MAC）、SS 瓊脂均購自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；無支原體胎牛血清購自浙江天杭生物科技有限公司；藥敏紙片購自杭州微生物試劑有限公司；1、2、7、11 型RA 陽性血清由齊魯制藥有限公司動保研究所提供；改良馬丁肉湯培養(yǎng)基購自榮成雨林生物有限公司；吐溫80、白油購自鄭州益康生物有限公司。

1.3 細(xì)菌的分離無菌挑取病死鴨的腦組織，分別劃線接種于5%胎牛血清NA 培養(yǎng)基、MAC 培養(yǎng)基、SS 培養(yǎng)基，5%胎牛血清NA 平板置37 ℃5%CO2培養(yǎng)24 h，MAC 培養(yǎng)基、SS 培養(yǎng)基置37 ℃培養(yǎng)24 h。挑取可疑菌落進(jìn)行純培養(yǎng)，觀察菌落形態(tài)。

1.4 細(xì)菌PCR 鑒定將1.3 中純化培養(yǎng)的菌落用無菌ddH2O 吹 下，5000 r/min 離 心5 min，棄 掉2/3 上清，將沉淀與剩余ddH2O 吹打混勻，沸水浴10 min，5000 r/min 離心5 min，取上清液作為模板，利用細(xì)菌16S rRNA 通用引物進(jìn)行擴(kuò)增[8]，產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序，測序結(jié)果與GenBank 中登錄的RA 序列進(jìn)行BLAST 比對分析。根據(jù)文獻(xiàn)[9]中提供的RA 序列，合成RA camp 基因鑒定引物，采用PCR 方法進(jìn)一步鑒定。

1.5 細(xì)菌血清型鑒定將1.3 中純化培養(yǎng)的菌落用無菌PBS 吹下作為待檢菌液，取1、2、7、11 型RA陽性血清25 μL 與25 μL 菌液進(jìn)行凝集試驗(yàn)[10]，對分離菌株進(jìn)行血清型鑒定。

1.6 藥敏試驗(yàn)參照《獸醫(yī)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)》圓紙片擴(kuò)散法[11]，檢測分離菌對常用的頭孢類、青霉素類、氨基糖苷類、四環(huán)素類、氟喹諾酮類、氯霉素類、大環(huán)內(nèi)酯類、林可霉素類、磺胺類、多肽10類18 種抗生素的敏感性。

1.7 動物回歸試驗(yàn)及最小致死量的測定將RA 菌株接種于改良馬丁肉湯培養(yǎng)基培養(yǎng)，將擴(kuò)增后的菌液10 倍倍比稀釋后（104cfu/mL～107cfu/mL），經(jīng)胸部肌肉注射（1 mL）感染28 日齡商品鴨，每個劑量感染5 只，陰性對照5 只，觀察一周內(nèi)鴨子臨床癥狀及發(fā)病死亡情況，剖檢觀察病理變化，并計(jì)算最小致死量。參照1.3～1.5 所述方法分離鑒定細(xì)菌。

1.8 分離株滅活油苗的制備和免疫保護(hù)試驗(yàn)擴(kuò)增RA-sd01 菌液，平板計(jì)數(shù)，用3‰甲醛滅活24 h，滅活菌液8 000 r/min 離心10 min，棄上清，根據(jù)平板計(jì)數(shù)結(jié)果用0.85%滅菌生理鹽水將菌液濃縮至1.5×1010cfu/mL，加入4%吐溫-80 混合均勻，并與白油按1:2 比例乳化，油苗中菌株的最終濃度為5×109cfu/mL。

將7 日齡健康商品鴨分為3 組，每組10 只，A組免疫某疫苗公司疫苗，B 組免疫自制疫苗，C 組為空白對照組，免疫方式為頸部皮下注射，每只注射0.5 mL，詳細(xì)信息見表1。

表1 動物實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Animal experiment design

免疫后21 d，用培養(yǎng)后的RA-sd01 株攻毒，胸肌注射，每只鴨子攻毒菌株菌量為106cfu/只，攻毒后一周內(nèi)觀察鴨子的發(fā)病或死亡情況。

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)結(jié)果無菌操作，對病死鴨的腦組織病料樣品進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)，MAC 平板、SS 瓊脂平板上未見細(xì)菌生長，5%血清NA 培養(yǎng)基平板上生長出均勻一致的菌落，表面光滑，呈水滴狀，稍隆起，圓形，邊緣整齊，45°角對光觀察可見淡藍(lán)色熒光，與RA 菌落特征一致。

2.2 細(xì)菌的PCR 鑒定結(jié)果利用16S rRNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，結(jié)果顯示未加細(xì)菌DNA 模板空白對照無擴(kuò)增條帶，分離株樣本可以擴(kuò)增片段大小為1500 bp左右單一條帶，與預(yù)期結(jié)果一致（圖1），擴(kuò)增產(chǎn)物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序，測序結(jié)果在BLAST 中進(jìn)行比對，結(jié)果顯示，該分離株與RA 同源性在99%～100%，根據(jù)分類標(biāo)準(zhǔn)，初步確定該分離株為RA。

參考羅玲等報道的PCR 鑒定方法[9]，應(yīng)用RA camp 鑒定引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，結(jié)果得到與目的片段610 bp 大小一致的單一條帶（圖1），進(jìn)一步表明該分離株為RA，命名為RA-sd01 株。

2.3 細(xì)菌的血清型鑒定結(jié)果利用凝集試驗(yàn)檢測該分離菌株血清型，結(jié)果顯示，該分離株與1 型RA標(biāo)準(zhǔn)陽性血清混合后玻片上出現(xiàn)顆粒狀凝集，與2、7、11 型標(biāo)準(zhǔn)陽性血清混合后均不出現(xiàn)顆粒狀凝集，表明該分離株血清型為1 型RA。

圖1 分離菌的PCR 鑒定結(jié)果Fig.1 Identification of the isolation bacteria by PCR

2.4 藥敏試驗(yàn)結(jié)果采用紙片擴(kuò)散法檢測分離菌對10 類18 種抗生素的藥物敏感性，結(jié)果顯示，該細(xì)菌對頭孢類藥物、氟苯尼考、多西環(huán)素、紅霉素等較敏感，具體藥敏信息見表2。

2.5 動物回歸試驗(yàn)與最小致死量測定結(jié)果利用不同濃度分離菌菌液感染實(shí)驗(yàn)鴨，感染后連續(xù)觀察7 d，具體結(jié)果見表3。觀察臨床癥狀與鴨場病死鴨一致，發(fā)病死亡實(shí)驗(yàn)鴨死亡前期可見精神萎靡、有神經(jīng)癥狀、料量減少、眼瞼流淚；剖檢實(shí)驗(yàn)鴨觀察病理變化顯示，肝臟腫大，心臟、肝臟表面有纖維素膜附著，與鴨場病死鴨相似，對病死鴨進(jìn)行腦部細(xì)菌分離，均分離鑒定到1 型RA，表明分離菌株RA-sd01 為該次種鴨場暴發(fā)疫病的病原菌。根據(jù)死亡情況，計(jì)算出該菌株對鴨群的最小致死量為6.9×105cfu/mL。

表2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Drug sensitivity results

表3 最小致死量結(jié)果Table 3 The minimum lethal dose of RA-sd01 strain

2.6 免疫保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果免疫后21d 用RA-sd01 菌株攻毒，結(jié)果顯示，未免疫組鴨24 h 開始發(fā)病，精神沉郁，縮頭，不吃料，48 h 開始出現(xiàn)死亡，截止至120 h 共死亡9/10 只，剖檢均出現(xiàn)包心包肝癥狀，對腦進(jìn)行細(xì)菌分離，10 只鴨均分離到1 型RA。免疫攻毒組鴨精神狀態(tài)良好，采食量正常，A 組B 組均未出現(xiàn)死亡，120 h 剖檢時A 組包心包肝占2/10，腦1型RA 分離率為2/10，B 組包心包肝占1/10，腦1 型RA 分離率為1/10，具體信息見表4。該免疫攻毒試驗(yàn)表明，同血清型疫苗對RA 的保護(hù)率達(dá)到90%。

表4 免疫攻毒保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Test results of immune challenge protection

3 討 論

通過剖檢、細(xì)菌分離鑒定和動物回歸試驗(yàn)，確定該種鴨場疾病的發(fā)生是由1 型RA 導(dǎo)致。根據(jù)以往報道，鴨傳染性漿膜炎多見于2～8 周齡雛鴨，成年鴨罕見發(fā)病[1]。本研究在前期排除幾種常見病毒病感染的基礎(chǔ)上，確診一例29 周齡父母代種鴨1 型RA 感染，但發(fā)病的周齡與近年來報道病例不同。羅玲等在湖北省某鴨場10日齡雛鴨分離到一株1型RA[10]；雷云等在貴州省某鴨場25 日齡病死鴨分離到4/6 的2 型RA[1]；陸新浩等對寧波各地送診的14 d～21 d 左右有典型氣囊炎、肝包膜炎、心包膜炎的病鴨或死鴨的肝臟、腦分離到RA[6]；以上報道均為小周齡鴨感染RA，對于成年鴨發(fā)病報道極少。本研究證明RA 可以引起成年鴨群發(fā)病，提示臨床上應(yīng)重視產(chǎn)蛋鴨RA 感染的風(fēng)險，加強(qiáng)鴨傳染性漿膜炎防控。

感染RA 后，2～8 周齡感染鴨最明顯的病變是臟器漿膜面有纖維素性滲出，以肝臟和心臟最為明顯，還可出現(xiàn)腦膜炎、氣囊炎和輸卵管炎等[12-14]，由于血腦屏障的作用，藥物很難進(jìn)入腦組織，使用藥物后其他臟器藥物濃度較高，能夠有效減少細(xì)菌的侵害，而腦中血藥濃度較低，成為細(xì)菌繁殖的主要場所，從而導(dǎo)致腦膜炎的發(fā)生[15]。

針對RA 的感染，大多采用抗生素治療[16]，隨著周齡的增大，藥物的使用逐漸增多，對藥物的耐藥性逐漸增強(qiáng)，病原菌易產(chǎn)生耐藥性，呈現(xiàn)多重耐藥趨勢[17]。本研究藥敏結(jié)果顯示，RA-sd01 株對9 種常見抗生素呈現(xiàn)多重耐藥現(xiàn)象，僅對頭孢類、氟苯尼考、多西環(huán)素、紅霉素等較敏感。但氟苯尼考具有胚胎毒性，妊娠期和哺乳期慎用，產(chǎn)蛋期應(yīng)禁止氟苯尼考的使用，疾病一旦發(fā)生，可緊急注射頭孢，多西環(huán)素拌料飼喂。

當(dāng)前預(yù)防控制該病發(fā)生的最有效手段就是RA疫苗，但是RA 血清型眾多，迄今我國已發(fā)現(xiàn)21種，不同血清型菌株之間的交叉保護(hù)低、毒力差異大[17]，給該病的防控增加了難度?？尚械姆椒ㄊ遣捎貌▲喎蛛x的RA 菌株制備疫苗，能夠更有效地控制該病在當(dāng)?shù)伉喨褐械牧餍衃18]。應(yīng)用本研究分離株RA-sd01 株制備滅活苗，通過免疫攻毒保護(hù)試驗(yàn)，保護(hù)率可達(dá)到90%，高于市售商品化疫苗，與嵇辛勤和王小蘭等報道相符[18-19]，可以提供良好的免疫保護(hù)力。免疫保護(hù)實(shí)驗(yàn)證實(shí)RA-sd01 株可以作為現(xiàn)地候選疫苗株，可以通過優(yōu)化免疫佐劑等進(jìn)一步提高免疫保護(hù)率。本研究為當(dāng)?shù)赜行ьA(yù)防控制鴨群RA 感染和種鴨場RA 凈化奠定了基礎(chǔ)。