胡紫萌，王卓昊，吳 坤，徐正軍，魏 丹，郭庚霖，李 敏，董永毅，張 煒*

（1. 南京農業(yè)大學 動物醫(yī)學院，江蘇 南京 210095；2. 江蘇省動物疫病預防控制中心，江蘇 南京 210036）

禽致病性大腸桿菌（Avian pathogenic Escherichia coli，APEC）屬于腸道外致病性大腸桿菌（Extraintes?tinal pathogenic Escherichia coli，ExPEC）[1]，可引起禽大腸桿菌病，肝周炎、心包炎、氣囊炎等炎癥，并可引起禽類的大量死亡。APEC 也常感染鴨鵝等水禽，而江蘇省作為水禽養(yǎng)殖大省，感染APEC 水禽的發(fā)病和死亡會給養(yǎng)殖業(yè)造成重大的經濟損失。隨著對抗生素的大范圍應用甚至濫用，使得大腸桿菌對常用抗生素的耐藥性日益嚴重，給臨床治療帶來了嚴峻的挑戰(zhàn)[2]。目前檢測細菌耐藥表型的傳統(tǒng)方法主要有紙片擴散法、肉湯稀釋法、E 試驗、MIC 值測定法，其中，藥敏紙片法是實驗室檢測和醫(yī)院臨床檢測較為常用的方法。另外，也可以根據(jù)細菌耐藥相關基因的檢測，對細菌的耐藥性進行評估和分析[3]。

本研究對2018 年～2019 年從蘇北及周邊地區(qū)某水禽養(yǎng)殖場采集的228 份水禽病料中分離鑒定APEC，并對分離的APEC 進行耐藥表型以及耐藥基因的檢測，為探究蘇北及周邊地區(qū)APEC 的耐藥性以及耐藥機制提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料大腸桿菌ATCC25922 質控菌株為本實驗室保存；228 份臨床樣品為本實驗室于2018 年12 月～2019 年4 月采集自蘇北及周邊地區(qū)水禽養(yǎng)殖場發(fā)病死亡的水禽（鴨頭78 份、鴨肝61 份；鵝頭55、鵝肝34 份）。

Todd Hewitt Broth 購自美國BD 公司；麥康凱培養(yǎng)基、MH 培養(yǎng)基、LB 培養(yǎng)基購自青島海博生物技術有限公司；綿羊血購自南京鼎思生物技術有限公司；藥敏紙片購自杭州微生物試劑有限公司；ddH2O、2xRapid TaqMaster Mix 購自南京諾唯贊生物科技有限公司。

1.2 臨床樣品的分離培養(yǎng)與PCR 鑒定采用接種環(huán)蘸取采集的鴨鵝腦組織或肝臟樣品，涂布在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上，置于37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察菌落生長情況并挑取麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上的單菌落，置于THB 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)4 h～6 h 后，對細菌進行革蘭氏染色鏡檢。同時采用APEC 特異性檢測引物進行菌液PCR 檢測，PCR 產物由蘇州金唯智公司測序，引物序列：EC-F：GCCTCGCCTGGAGAATGA/EC-R:CCTGAGACTGCGGTGGAA[4]，引物由南京擎科生物有限公司合成。

1.3 分離菌株的藥敏試驗參照CLSI（Clinical and Laboratory Standard Institute，2019）推薦的K-B 紙片擴散法及結果判定，將1.2 分離的菌株進行8 大類，共計11 種藥物的藥敏試驗。包括青霉素類：氨芐西林；頭孢類：頭孢噻肟；碳青霉烯類：美羅培南；氨基糖苷類：慶大霉素、丁胺卡那霉素、鏈霉素；四環(huán)素類：四環(huán)素；氟喹諾酮類：氧氟沙星、恩諾沙星；硝基呋喃類：呋喃妥因；氯霉素類：氟苯尼考，以ATCC25922 為質控菌株。同時分析分離菌株的多重耐藥情況。

1.4 分離菌株的耐藥基因檢測設計包括碳青霉烯類（NDM、KPC、GES、SME、IMI）、β-內酰胺類（TEM、CTX-M、SHV）、氨基糖苷類（aac（3'）- Ib、ant（3''）- Ia）、磺胺類（sul I）、粘菌素類（mcr-1）、喹諾酮類（qnrB、parC）、四環(huán)素類（tetA、tetB）7 大類共計16 對耐藥基因檢測引物（如讀者需要作者可以提供相關引物信息）。以1.2 THB 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)4 h～6 h 得到的菌液為模板，采用相應引物分別進行PCR 擴增其耐藥基因。

1.5 分離APEC 的改良Hoge 試驗參照文獻[5]，采用改良Hoge 試驗檢測1.3 分離菌株藥敏試驗中對美羅培南耐藥的APEC 菌株是否產碳青霉烯酶：將0.5 號麥氏標準濁度的大腸桿菌ATCC25922 菌懸液用MH 培養(yǎng)基按1:10 稀釋后按照常規(guī)藥敏試驗操作要求接種到MH 瓊脂（MHA）平板上，于3 min～10 min 后將美羅培南藥敏紙片貼于平板中央，以此為指示菌。經1.4 耐藥基因檢測結果確定的產碳青霉烯酶類耐藥基因的APEC 劃線接種于血瓊脂培養(yǎng)板上過夜培養(yǎng)，分別挑取其3～5 個單菌落，在上述MHA 平板上由平板邊緣向中心劃線接種，接種線長20 mm～25 mm。將以上平板置于37 ℃孵育16 h～20 h，檢查MHA 平板上的APEC 菌株的劃線部分與美羅培南紙片抑菌圈邊緣交叉部分的ATCC25922 是否出現(xiàn)了類似蘋果蒂樣形狀的增強性生長。

2 結 果

2.1 樣品中的細菌分離鑒定結果將采集的鴨或者鵝的腦組織或肝臟組織樣品劃線接種于麥康凱培養(yǎng)基上，結果可見，在麥康凱培養(yǎng)基上長出紅色、圓形、扁平、邊緣整齊、表面光滑的菌落。挑取紅色菌落經涂片固定后進行革蘭氏染色后的細菌呈兩端呈鈍圓形，藍紫色的棒狀桿菌，與大腸桿菌的形狀一致。將上述菌提取基因組后經特異性APEC PCR 鑒定并經測序結果比對，最后確定從228 份水禽樣品中分離到了50 株APEC，其中從鴨的肝臟樣品中分離到20株，鴨的腦組織樣品中分離到7株，從鵝的肝臟樣品中分離到12 株，鵝的腦組織樣品中分離到11 株。結果表明，在鴨、鵝中均出現(xiàn)了APEC，且在其肝臟、腦組織樣品中均有分布。

圖1 分離菌株的革蘭氏染色結果（1 000×)Fig.1 The gram staining of the bacterial isolate(1 000×)

2.2 分離的APEC 藥敏試驗結果藥敏試驗結果顯示，分離的APEC 對美羅培南、呋喃妥因、丁胺卡那霉素較敏感，對其耐藥的菌株僅占4%（2/50）、4%（2/50）、6%（3/50）；對慶大霉素、氧氟沙星、鏈霉素、恩諾沙星中等耐藥，耐藥菌株占26%（13/50）、36%（18/50）、58%（29/50）、70%（35/50）；對頭孢噻肟、氟苯尼考、氨芐西林、四環(huán)素的耐藥性較高，耐藥菌株分別占76%（38/50）、86%（43/50）、96%（48/50）、100%（50/50）（表1）。其中耐9 種抗生素的菌株占6%（3/50），耐8 種抗生素的菌株占6%（3/50），耐7 種抗生素的菌株占12%（6/50），耐6 種抗生素的菌株占28%（14/50），耐5 種抗生素的菌株占22%（11/50），耐4 種抗生素的菌株占16%（8/50），耐3 種抗生素的菌株占2%（1/50），耐2種抗生素的菌株占2%（1/50），耐1種抗生素的菌株占4%（2/50）（圖2）。上述結果表明分離到的APEC 耐藥性較強，多重耐藥現(xiàn)象較嚴重。

2.3 分離的APEC 耐藥基因檢測結果對分離菌株的耐藥基因進行PCR 檢測，結果顯示，碳青霉烯類耐藥基因NDM 的檢出率為4%（2/50），未檢出KPC、GES、SME、IMI 基因；β-內酰胺類：TEM的檢出率為58%（29/50），CTX-M 的檢出率為60%（30/50），SHV 的檢出率為20%（10/50）；氨基糖苷類：ant（3''）- Ia）的檢出率為0，aac（3'）- Ib 的檢出率為50%（25/50）；磺胺類：sul I 的檢出率為82%（41/50）；粘菌素類：mcr-1的檢出率為6%（3/50）；喹諾酮類：qnrB的檢出率為68%（34/50），parC的檢出率為98%（49/50）；四環(huán)素類：tetA 的檢出率為66%（33/50），tetB 的檢出率為10%（5/50）。表明分離的APEC對parC、sul I、qnrB、CTX-M 的耐藥基因檢出率較高，且其對美羅培南、頭孢噻肟、四環(huán)素的耐藥表型與其耐藥基因均存在相關性。

表1 分離的APEC 藥敏試驗結果Table 1 Statistics showing the results of drug susceptibility test on APEC

圖2 50 株APEC 對11 種抗生素的多重耐藥統(tǒng)計結果Fig.2 Statistics showing the results of multiple drug resistance of the 50 APEC isolates to 11 antibiotics

2.4 分離APEC 的改良Hoge 試驗結果在2.2 的藥敏試驗中發(fā)現(xiàn)了2 株對碳青霉烯類抗生素美羅培南耐藥的APEC，且該兩株APEC 均攜帶碳青霉烯類耐藥基因NDM，將其命名為EC162、EC171。經改良Hoge 試驗結果顯示，平板中的抑菌圈出現(xiàn)了類似蘋果蒂樣的形狀，是由于EC162 和EC171 產生的碳青霉烯酶擴散到了美羅培南產生的抑菌圈區(qū)域中水解了該抗生素，使得該該區(qū)域中沒有足夠的美羅培南抑制大腸桿菌ATCC25922，使ATCC25922 出現(xiàn)了類似蘋果蒂樣形狀的增強性生長（圖3）。確認2 株菌均產碳青霉烯酶，可以水解碳青霉烯類抗生素，所以其對碳青霉烯類抗生素菌耐藥。

圖3 APEC 產碳青霉烯酶的改良Hoge 試驗結果Fig.3 Results of modified Hoge test of carbapenems produced by APEC

3 討 論

抗生素一直是治療細菌病的主要手段，但是隨著對抗生素的不合理用藥，導致細菌發(fā)生了基因轉移或突變等產生了耐藥性，給養(yǎng)殖場的臨床用藥帶來了極大的挑戰(zhàn)。本研究在蘇北及周邊地區(qū)的水禽養(yǎng)殖場中分離到了50 株APEC，對其進行了耐藥表型和耐藥基因型的檢測。藥敏試驗結果顯示，分離的APEC 對四環(huán)素、氨芐西林、氟苯尼考的耐藥情況嚴重，耐藥菌株分別高達100%、96%、86%，其中分離菌株對四環(huán)素的高耐藥性可能是由于四環(huán)素長期被加入到畜禽飼料中作為添加劑所致。分離的APEC 對頭孢噻肟、恩諾沙星、鏈霉素、氧氟沙星的耐藥較為嚴重，耐藥菌株分別占76%、70%、58%、36%；對美羅培南、呋喃妥因、丁胺卡那霉素的耐藥性較低，耐藥菌株僅分別占4%、4%、6%。氨基糖苷類的丁胺卡那霉素（敏感菌株占94%）作為畜禽養(yǎng)殖場臨床常用藥，其抗大腸桿菌效果良好，但是隨著其頻繁的使用，細菌在該抗生素的選擇壓力下也將會逐漸對其產生耐藥性，因此在臨床用藥中要規(guī)范化的使用該抗生素。分離的APEC 雖然大多數(shù)均對硝基呋喃類的呋喃妥因（敏感菌株占82%）敏感，由于其會影響動物性食品安全，已被我國農業(yè)部規(guī)定禁用于食品動物。Solà-Ginés M 等人于2012 年在西班牙分離到的22 株APEC 中，對氨芐西林、頭孢噻肟、丁胺卡那霉素、慶大霉素、氟苯尼考的耐藥菌株分別占22%、41%、81%、84%、94%[6]。其中對氟苯尼考的耐藥菌株比例與本研究無明顯差異，而對氨芐西林、頭孢噻肟、丁胺卡那霉素、慶大霉素的耐藥情況則與本研究差異較大。Dou X 等人于2016 年在中國東部分離的243 株APEC中，對四環(huán)素耐藥的菌株占98%，對鏈霉素的耐藥菌株占79%[7]，與本研究的APEC 對四環(huán)素和鏈霉素的耐藥結果無明顯差異。Subedi M 等人于2018 年在印度分離的50 株APEC 中，對氨芐西林、丁胺卡那霉素、呋喃妥因均較敏感，敏感菌株分別占98%、84%、55%[8]，除了丁胺卡那霉素外，其分離的APEC 對其他抗生素的耐藥性均與本研究存在明顯差異。國內外APEC 對同一種抗生素的耐藥性間的差異，可能與采樣地域、采樣時間、采樣對象以及用藥背景有關，這也從一定角度表明不同地區(qū)的APEC 菌株存在遺傳多樣性。

分離的APEC 菌株的多重耐藥現(xiàn)象較嚴重，耐4、5、6、7 種抗生素的現(xiàn)象較普遍，共占78%。提示了蘇北及周邊地區(qū)水禽源APEC 嚴峻的耐藥情況，這可能與養(yǎng)殖場長期不合理使用抗生素有關。雖然本研究APEC 的耐藥結果與國內外的部分研究結果存在一些差異，但大體上與國內外APEC 的耐藥趨勢相符：隨著獸醫(yī)臨床對抗生素的不斷使用，耐藥的APEC 菌株和多重耐藥菌株數(shù)均在逐漸增加，耐藥情況愈來愈嚴重。

耐藥基因檢測結果顯示，除了碳青霉烯類和粘菌素類抗生素的耐藥基因外，其他每種抗生素都有相關耐藥基因的檢出。耐藥表型和耐藥基因之間也存在著一定的關聯(lián)性，例如50 株APEC 中，僅2 株APEC 對美羅培南耐藥，并均檢測到其耐藥基因NDM，其余48 株APEC 均未檢測出與碳青霉烯類抗生素相關的KPC、GES、SME、IMI 耐藥基因。表明，由于碳青霉烯類抗生素禁用于動物，分離的APEC 大多對該藥物敏感，且與其相關的耐藥基因的檢出率也較少。β-內酰胺類抗生素中的3 種常見耐藥基因：CTX-M、TEM、SHV 的檢出率較高，分別為60%、58%、20%。其中的CTX-M 是一種新型的超廣譜β-內酰胺酶（Extended Spectrum Beta-lac?tamases，ESBLs），具有較強的水解頭孢噻肟的能力，已成為亞洲國家流行的主要耐藥基因型，這與Bonne R 等人研究的結果相符[9]。CTX-M 型ESBLs 在歐美等發(fā)達國家也有流行的趨勢，有研究表明食源性動物中長期持續(xù)使用頭孢噻肟等抗生素作為生長促進劑也會促進含ESBLs 病原菌的傳播[10-11]。上述結果表明，不同的國家中均存在β-內酰胺類抗生素耐藥性較嚴重的現(xiàn)象。

碳青霉烯類抗生素和多粘菌素一直被認為是抗革蘭陰性菌感染的“最后一道防線”，碳青霉烯類抗生素是抗菌譜最廣，抗菌活性最強的非典型β-內酰胺類抗生素，碳青霉烯類藥物耐藥菌的增加會給臨床治療帶來極大的挑戰(zhàn)[12]。2013 年，美國疾病控制和預防中心（CDC）發(fā)布了一份報告，概述了美國排名前18 位的抗藥性威脅：碳青霉烯類耐藥腸桿菌科位列其中[13]。目前，在世界范圍內均出現(xiàn)了產碳青霉烯酶的細菌，特別是產新德里金屬β-內酰胺酶（NDM-1）及其變體的細菌[14]。碳青霉烯類耐藥基因NDM 自首次報道以來，便在全球范圍內開始流行，雖然碳青霉烯類藥物禁用于獸醫(yī)臨床，然而近幾年國內外學者卻均從食品動物源腸桿菌中檢測到NDM基因，給人類健康帶來嚴重威脅[15]。本研究在分離APEC 的藥敏試驗中發(fā)現(xiàn)了2 株APEC 對碳青霉烯類的美羅培南耐藥，經PCR 檢測出2 株菌均攜帶碳青霉烯類耐藥基因NDM，經改良Hoge 試驗檢測該兩株菌均產碳青霉烯酶，水禽中出現(xiàn)了碳青霉烯類耐藥大腸桿菌，這與劉志海等人的研究一致[16]。在動物中檢測到了NDM 基因，推測原因可能是通過攜帶NDM 基因的養(yǎng)殖場工作人員和動物間產生了交叉感染，或者是通過環(huán)境傳播，例如動物食入了攜帶NDM 基因的食物，或者是其接觸的環(huán)境中含有攜帶NDM 基因的耐藥菌株等。

隨著近年來對多粘菌素臨床使用的增加，對其耐藥的相關研究及報道也在增多[12]。Yang 等人于2010 年～2015 年對13 個中國省份雞的大腸桿菌進行的調查顯示，在4%（58/1136）的分離菌株中檢測到多粘菌素耐藥基因mcr-1[17]；張召興等人于2019 年從河北地區(qū)的禽中分離的42 株APEC 中發(fā)現(xiàn)32 株攜帶mcr-1[18]；而本研究從50 株水禽源APEC 中僅鑒定出3 株mcr-1 陽性APEC，推測可能是由于不同地區(qū)養(yǎng)禽場抗生素使用情況不同或者是采樣的隨機性等原因導致了較大的耐藥性差異。多粘菌素很少用于人醫(yī)臨床，但有研究顯示在人的致病性大腸桿菌中出現(xiàn)了大量攜帶多粘菌素耐藥基因mcr-1 的菌株，推測人可以通過接觸或者食用攜帶mcr-1APEC 的動物，從而使得mcr-1 基因從動物傳播到人[19]。

本研究對蘇北及周邊地區(qū)的水禽養(yǎng)殖場的鴨源、鵝源APEC 的耐藥性進行了詳細的分析，為后續(xù)APEC 耐藥機制的研究奠定基礎，為臨床治療相關疾病提供參考。