朱遠(yuǎn)茂，陳瑞紅，林 俊，楊木嬌，薛 飛

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所 獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150069）

副流感病毒3 型（Parainfluenza virus3，PIV3）屬于副黏病毒科呼吸道病毒屬成員，為有囊膜的單股負(fù)鏈RNA 病毒。目前已報(bào)道的呼吸道病毒屬的成員主要包括人副流感病毒1 型（Human parainfluenza vi?rus type 1，HPIV1）、人副流感病毒3 型（Human para?influenza virus type 3，HPIV3）、牛副流感病毒3 型（Bovine parainfluenza virus type 3，BPIV3）和仙臺(tái)病毒（Sendai virus，SV）等[1-2]。PIV3 感染主要引起宿主呼吸道系統(tǒng)疾病，癥狀主要表現(xiàn)為流涕、流淚、咳嗽或呼吸困難，部分宿主表現(xiàn)體溫升高，如繼發(fā)細(xì)菌或支原體感染可引起病情加重，導(dǎo)致呼吸道疾病綜合癥，造成宿主的死亡。

Hore 于1966 年最早報(bào)道了從綿羊體內(nèi)分離到PIV3[3]，隨后在歐美陸續(xù)有該病毒的分離報(bào)道，并開(kāi)展了致病性及疫苗研究，但從二十世紀(jì)九十年代以后對(duì)該病研究甚少。2014 年我國(guó)報(bào)道了從表現(xiàn)患呼吸道疾病山羊的鼻拭子和血清樣品中檢測(cè)到PIV3，并分離到一株病毒，命名為山羊副流感病毒3型（Caprine parainfluenza virus 3，CPIV 3）JS2013 株[4]。2019 年國(guó)內(nèi)學(xué)者毛立等采用qRT-PCR 對(duì)1863 份綿羊血清樣品進(jìn)行PIV3 的檢測(cè)，結(jié)果陽(yáng)性率達(dá)21.5%，序列分析均為CPIV3[5]。

到目前為止，我國(guó)未有綿羊副流感病毒3 型（Ovine parainfluenza virus type 3，OPIV3）的報(bào)道。本研究對(duì)一患急性呼吸道疾病死亡綿羊的鼻拭子、氣管灌洗液、胸腔積液和肺臟進(jìn)行了病毒分離，結(jié)果從其胸腔積液中分離到一株病毒，經(jīng)特征性的CPE、電鏡觀察和序列分析鑒定為OPIV3，命名為PE2019 株，系國(guó)內(nèi)首次分離報(bào)道，為了解國(guó)內(nèi)OPIV3 的流行情況及疫苗的研制奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病料樣品來(lái)源2019 年哈爾濱獸醫(yī)研究所動(dòng)物疫病診斷中心接診一患呼吸道疾病死亡的綿羊，采集其鼻拭子、氣管灌洗液、胸腔積液和肺臟，于含3%小牛血清的α-MEM 中，于-20℃以下保存。

1.2 主要試劑MDBK 由本實(shí)驗(yàn)室保存；RNA 提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒均購(gòu)自AXYGEN 公 司；M-MuLV 反 轉(zhuǎn) 錄 酶（200 U/μL）、HPRI RNA 酶抑制劑（40 U/μL）、DL 2000 DNA Marker、ExTaq 酶、IPTG 購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；T4 DNA 連接酶、pGEM-T 購(gòu)自Promega 公司。

1.3 病毒分離鼻拭子、氣管灌洗液和胸腔積液均充分震蕩后擠壓吸取浸出液，3 000 r/min 4 ℃離心10 min，取上清液經(jīng)0.22 μm 的濾器過(guò)濾除菌后備用。取肺部病料樣品約1 cm3，剪碎，加入2 mL含3%小牛血清的MEM 培養(yǎng)液，置小量組織勻漿器中充分研磨，3 000 r/min 4 ℃離心10 min，取上清液經(jīng)0.22 μm的濾器過(guò)濾除菌后備用。上述處理的樣品接種于MDBK細(xì)胞，37 ℃5% CO2培養(yǎng)觀察是否出現(xiàn)細(xì)胞病變（CPE），出現(xiàn)CPE 者繼續(xù)培養(yǎng)至CPE 達(dá)到80%時(shí)收毒，繼續(xù)傳代至F3；培養(yǎng)96 h 之后無(wú)CPE 的培養(yǎng)物盲傳3 代，如仍未出現(xiàn)CPE 者廢棄。

1.4 病毒含量（TCID50）的測(cè)定將分離株F3 代病毒液用維持培養(yǎng)液10 倍倍比稀釋至10-8，每個(gè)稀釋度做8 孔重復(fù)，接種長(zhǎng)成單層的96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中的MDBK 細(xì)胞，并設(shè)正常細(xì)胞對(duì)照，100 μL/孔，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)，每天觀察細(xì)胞病變，共培養(yǎng)7 d，記錄CPE 孔數(shù)，根據(jù)Reed-Muench 法計(jì)算病毒的TCID50。

1.5 電鏡觀察將分離病毒株接種MDBK 細(xì)胞，待80%出現(xiàn)CPE 后進(jìn)行反復(fù)凍融3 次收毒，5 000 r/min離心15 min，取上清12 000 r/min 4 ℃離心30 min，取沉淀，2%磷鎢酸負(fù)染，電鏡觀察。

1.6 紅細(xì)胞凝聚試驗(yàn)（HA）將分離株P(guān)E2019 的F3 代病毒液于96 孔微量血凝板中2 倍倍比稀釋至211倍，50 L/孔，分別加入等量0.5%小鼠、豚鼠、雞、兔、綿羊和牛紅細(xì)胞懸液，室溫靜置1 h，檢測(cè)分離株P(guān)E2019 效價(jià)，以紅細(xì)胞100%凝集的病毒最大稀釋度為該病毒HA 效價(jià)，即為1 個(gè)凝集單位。

1.7 RT-PCR 檢測(cè)和分析參考GenBank 中登錄的CPIV3 GS2017-2 株（MK091103）全基因組序列，分別設(shè)計(jì)并合成擴(kuò)增其N 和M 基因引物，其中擴(kuò)增N 基因的引物序列為NF：5'-CTATACTTAACAGCAAATGGC-3'/NR：5'-GCTCCATAATGCAGGATAATT-3'，產(chǎn)物長(zhǎng)度為747 bp；擴(kuò)增M 基因的引物序列為MF：5'-AAAGACTTGATCCACAACTCC-3'/MR：5'-GTGTTTGATCCTCTGGTGTTG-3'，產(chǎn)物長(zhǎng)度為1 203 bp。利用病毒RNA 小量提取試劑盒提取病毒基因組RNA，利用NF 引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA 進(jìn)行PCR。PCR 反應(yīng)體系為1.0 μL ExTaq（5 U/μL）、5 μL 10×ExTaq Buffer、5 μL dNTP（2.5 mmoL/L）、上下游引物（20 μmoL/μL）各1μL，加水至50 μL。PCR 反應(yīng)條件93 ℃3 min；94 ℃45 s、52 ℃45 s、72 ℃2 min，30 個(gè) 循 環(huán)；72 ℃10 min。將PCR 產(chǎn)物采用1%瓊脂糖凝膠電泳分析。

將PCR 陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物膠回收純化后由博仕生物公司進(jìn)行序列測(cè)定，測(cè)序結(jié)果與GenBank 中登錄的CPIV3、BPIV3 和HPIV3 參考株進(jìn)行序列比較，利用DNAStar 和MEGA X 軟件進(jìn)行序列同源性分析，并繪制遺傳進(jìn)化樹(shù)。

2 結(jié) 果

2.1 病毒分離結(jié)果從患呼吸道疾病死亡綿羊采集的鼻拭子、氣管灌洗液和肺臟樣品接種MDBK 細(xì)胞并盲傳3 代均無(wú)CPE；胸腔積液接種MDBK 第1 代即出現(xiàn)CPE，特征為在一層良好的單層細(xì)胞表面形成一層細(xì)胞圓縮、集聚成簇、隨著時(shí)間的推移集聚的細(xì)胞破裂（圖1），與副黏病毒特征性CPE 相符，初步判斷該病毒為副黏病毒，將其命名為PE2019。

圖1 病毒分離株P(guān)E2019 在MDBK 上的CPEFig.1 The strain PE2019 induced CPE in MDBK cells

2.2 TCID50 測(cè)定結(jié)果分離病毒株P(guān)E2019 在10-5、10-6、10-7和10-8稀釋時(shí)分別出現(xiàn)CPE 的孔數(shù)為8孔、8 孔、3 孔和0 孔，按Reed-Muench 方法計(jì)算，病毒滴度為107.8TCID50/mL。

2.3 電鏡觀察結(jié)果病毒分離株P(guān)E2019 接種MDBK細(xì)胞上清，經(jīng)電鏡負(fù)染觀察可見(jiàn)帶有囊膜、圓形、直徑約300 nm 的病毒粒子（圖2）；此外，可觀察到病毒基因組釋放出核衣殼呈長(zhǎng)絲帶狀，與副黏病毒病毒粒子形態(tài)特征相符，進(jìn)一步證明分離株為副黏病毒。

圖2 分離株P(guān)E2019 病毒粒子電鏡圖Fig.2 Electron microscope image of the strain PE2019

2.4 血凝試驗(yàn)結(jié)果病毒分離株P(guān)E2019 F3代病毒均不凝集雞、兔、綿羊和牛的0.5%紅細(xì)胞，但對(duì)小鼠和豚鼠的0.5%紅細(xì)胞凝集效價(jià)均為26，凝集價(jià)較高。

2.5 RT-PCR 鑒定及序列分析結(jié)果提取分離株P(guān)E2019 基因組RNA，用NF 引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，再用N 和M 基因特異性引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，結(jié)果獲得分別約750 bp 和1 200 bp 的目的片段（圖3）。

圖3 分離株P(guān)E2019 的N 和M 基因RT-PCR 擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 Amplification of the N and M genefragments of the strain PE2019 by RT-PCR

對(duì)分離株P(guān)E2019的N和M基因進(jìn)行序列測(cè)定，截取N 基因的680 bp 的部分基因和M 基因全長(zhǎng)1 059 bp，與GenBank 中登錄的CPIV3、BPIV3 和HPIV3 的不同參考株序列進(jìn)行核苷酸序列同源性分析。結(jié)果顯示，N 基因序列同源性與3 類病毒中參考株最高分別為84.0%、82.1%和78.8%，M 基因序列同源性與3類病毒中參考株最高分別為81.5%、78.4%和77.6%，且N 和M 基因均為獨(dú)立一個(gè)分支（圖4）。表明分離株為PIV3，但與CPIV3、BPIV3 和HPIV3 均親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，為一新的病毒株，由于分離株是從綿羊體內(nèi)分離獲得，故將分離株確定為OPIV3。

圖4 基于Neighbor-Joining 法構(gòu)建分離株P(guān)E2019 的N 基因（A）和M 基因（B）核苷酸序列的遺傳進(jìn)化樹(shù)Fig.4 Neighbor joining phylogenetic tree about the N(A)and M(B)gene sequences of the OPIV3 strain PE2019

3 討 論

隨著養(yǎng)羊業(yè)的迅速發(fā)展，養(yǎng)殖密度不斷擴(kuò)大，規(guī)模化程度不斷加深，交易也更加頻繁。在轉(zhuǎn)群、調(diào)運(yùn)和天氣變化等應(yīng)激條件刺激下，羊抵抗力下降，極易造成呼吸道疾病流行。PIV3 是重要的呼吸道病原之一，2013 年江蘇等多地山羊陸續(xù)暴發(fā)呼吸道疾病，造成較大經(jīng)濟(jì)損失，經(jīng)病原學(xué)診斷CPIV3為主要病原[6]。血清流行病學(xué)調(diào)查證實(shí)許多地區(qū)（江蘇、安徽、吉林、山東和廣西等省或自治區(qū)）羊群中均存在CPIV3 的抗體[7-8]。以上病原學(xué)和血清學(xué)調(diào)查結(jié)果均顯示我國(guó)山羊存在較為嚴(yán)重的CPIV3 的感染。我國(guó)綿羊養(yǎng)殖數(shù)量龐大，2018 年國(guó)內(nèi)學(xué)者首次對(duì)綿羊是否存在CPIV3 的感染開(kāi)展了調(diào)查研究，對(duì)采集的綿羊鼻拭子和血清進(jìn)行抗原抗體檢測(cè)，結(jié)果顯示CPIV3 抗體陽(yáng)性率為59.3%（1793/3026），抗原陽(yáng)性率為21.5%（401/1863），并分離到11 株病毒，序列分析表明均為CPIV3[5]。至此，我國(guó)從山羊和綿羊體內(nèi)均檢測(cè)和分離到CPIV3，但未開(kāi)展OPIV3 的檢測(cè)和分離研究，因此我國(guó)山羊和綿羊群中是否存在OPIV3 的感染尚不清楚。

OPIV3 最早于1966 年在美國(guó)報(bào)道，隨后在歐美等國(guó)陸續(xù)報(bào)道。致病性研究表明OPIV3 經(jīng)氣管注射接種1 周齡不吃初乳羔羊，可引起肺部多病灶的實(shí)變，表現(xiàn)為毛細(xì)支氣管炎和間質(zhì)性肺炎[9]。本研究接診的患呼吸道疾病死亡綿羊的生前臨床癥狀為精神沉郁、厭食、咳嗽和流涕，剖檢后可見(jiàn)氣管內(nèi)充有黏液、肺實(shí)變和胸腔積液，符合OPIV3 感染的特征。采集鼻拭子、氣管灌洗液、肺臟和胸腔積液進(jìn)行病原學(xué)檢測(cè)和病毒分離，結(jié)果口蹄疫、小反芻獸疫和支原體檢測(cè)均為陰性，從胸腔積液中分離獲得一株病毒PE2019 株，證實(shí)本次疾病流行的主要病原為OPIV3。

令人遺憾的是到目前為止GenBank 中尚未登錄OPIV3 毒株的全基因組序列和M 基因的序列，這給OPIV3 的序列鑒定帶來(lái)了一定的困難。2008 年，澳大利亞學(xué)者Horwood 等對(duì)7 株BPIV3 分離株進(jìn)行序列分析并繪制系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果顯示為兩個(gè)明顯的分支，其中的4 株與BPIV3 經(jīng)典株（SF 株）的核苷酸序列同源性為83.1%，與氨基酸序列同源性為89.9%，均顯示很大的差異，認(rèn)為這4 株BPIV3 為一新的基因型，定為BPIV3 基因B 型（BPIV3b）[10]，隨后南美的阿根廷和北美的美國(guó)亦報(bào)道了BPIV3b 的存在，支持這一基因分型。2011 年本研究團(tuán)隊(duì)首次分離報(bào)道了BPIV3 新的基因型，定為BPIV3c[11]，隨后，阿根廷、韓國(guó)、日本和美國(guó)均報(bào)道了BPIV3c 的存在。至此，BPIV3 不同毒株間核苷酸序列同源性為95%以上，一般認(rèn)為是同一基因亞型；核苷酸序列同源性為80%～90%，一般認(rèn)為是不同基因亞型。不同宿主的PIV3 一般根據(jù)宿主進(jìn)行命名，進(jìn)一步分析表明不同宿主的PIV3 毒株之間的核苷酸序列同源性一般為70%～80%，研究資料顯示HPIV3、BPIV3 和CPIV3 之間全基因組序列同源性均為70%～80%[10-11]。借鑒上述BPIV3 基因亞型分類標(biāo)準(zhǔn)和不同宿主之間的PIV3 分類標(biāo)準(zhǔn)，本研究對(duì)分離株P(guān)E2019 的M 基因進(jìn)行了序列測(cè)定并與HPIV3、BPIV3 和CPIV3 的M基因核苷酸序列同源性進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果表明其序列同源性 分別 為77.3%～77.6%、77.9%～78.4%和80.8%～81.5%，親緣關(guān)系均較遠(yuǎn)，且在系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)上處于獨(dú)立的分支。鑒于分離株宿主為綿羊，故將其確定為OPIV3。

綜上所述，本研究結(jié)合患呼吸道疾病死亡綿羊生前臨床癥狀、疾病流行特點(diǎn)、分離病毒引起的CPE 特征、病毒形態(tài)特征和核苷酸序列分析，證明分離株P(guān)E2019 為OPIV3，系國(guó)內(nèi)首次分離報(bào)道，提示我國(guó)綿羊存在OPIV3 的感染，本研究為今后該病的流行病學(xué)、免疫學(xué)、致病機(jī)理和免疫預(yù)防等方面的進(jìn)一步研究奠定了良好基礎(chǔ)。