郭姣梅,郝建華,李曉涵,王 偉,孫晶晶,宋 凱

(1. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室海洋藥物與生物制品功能實(shí)驗(yàn)室， 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部極地漁業(yè)開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266071； 2. 上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海 201306)

0 引 言

環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(cyclodextrin glucanotransferase, CGTase，EC 2.4.1.19)屬于α-淀粉酶第13號(hào)家族的重要成員，能夠催化水解反應(yīng)、環(huán)化反應(yīng)、耦合反應(yīng)和歧化反應(yīng)。CGTase作為一種生物催化劑，主要用來(lái)催化淀粉轉(zhuǎn)化為α，β，γ-環(huán)糊精(CD)，CD因其具有外部疏水，內(nèi)部親水的獨(dú)特理化性質(zhì)，不僅用于食品行業(yè)[1-2]，在生物技術(shù)[3]、化妝品[4]、化學(xué)工業(yè)[5]、醫(yī)藥[6]、環(huán)境保護(hù)[7]等諸多領(lǐng)域也有著非常廣泛的應(yīng)用，其工業(yè)化生產(chǎn)將具有重要意義。CGTase也廣泛應(yīng)用于VC衍生物2-O-α-D-葡萄糖基-L-抗壞血酸(AA-2G)的生產(chǎn)。AA-2G被認(rèn)為是最穩(wěn)定、性能最佳的VC替代品。使用游離CGTase轉(zhuǎn)化合成CD或AA-2G，反應(yīng)結(jié)束后，游離的CGTase不易回收，且反應(yīng)成本較高。CGTase固定化能明顯提高其穩(wěn)定性和使用次數(shù)，降低反應(yīng)成本。G. G. Gimenez[8]等通過(guò)表面錨定和共價(jià)結(jié)合法將CGTase固定在二氧化硅上，并將固定化酶用于CD的生產(chǎn)。Zhang J[9]等報(bào)道了在聚乙烯亞胺存在下，將重組CGTase固定在聚多巴胺-Fe3O4納米顆粒上的研究，結(jié)果表明，固定化CGTase能高效生產(chǎn)β-環(huán)糊精。

磁性納米粒子作為一種吸附材料，具有高矯頑力、超順磁性和良好的生物相容性，以及粒徑小、比表面積大、吸附力強(qiáng)、易于磁液分離等優(yōu)點(diǎn)，故磁性納米材料在藥物輸送[10-11]、細(xì)胞分離[12]、固定化酶[13]、磁流體熱療和磁共振成像[14, 15]、癌癥診斷[16]等各個(gè)生物技術(shù)領(lǐng)域均有廣闊的應(yīng)用前景。然而， Fe3O4磁性納米粒子在空氣中易氧化，易團(tuán)聚，親水性差，這極大的限制了磁性納米粒子在生物技術(shù)領(lǐng)域的應(yīng)用。為增強(qiáng)其穩(wěn)定性及生物相容性，有必要對(duì)Fe3O4磁性納米粒子進(jìn)行表面改性。二氧化硅無(wú)毒無(wú)害、親水性好、具有良好的生物相容性，易于實(shí)現(xiàn)表面功能化，做為四氧化三鐵納米粒子的表面修飾材料受到廣泛關(guān)注[17-18]。

本研究采用化學(xué)共沉淀法制備Fe3O4納米粒子，在制備過(guò)程中加入聚乙二醇防止其團(tuán)聚，以正硅酸四乙酯(TEOS)為硅源包覆Fe3O4粒子，再將氨基偶聯(lián)劑3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)通過(guò)化學(xué)鍵結(jié)合到包硅磁性材料上，得到氨基硅烷化的磁性納米粒子，并用于CGTase的固定化研究。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 材料和試劑

氯化鐵(FeCl3·6H2O)，硫酸亞鐵(FeSO4·7H2O)，氨水(NH3·H2O)，正硅酸四乙酯(TEOS)，乙醇，以上均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，高純氮，聚乙二醇(PEG4000)，3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)，分析純，aladdin(阿拉丁)，甲苯，分析純，萊陽(yáng)經(jīng)濟(jì)技術(shù)開(kāi)發(fā)區(qū)精細(xì)化工廠(chǎng)；試驗(yàn)用水均為去離子水。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 磁性Fe3O4納米粒子的制備

參照琚彩霞等[19]方法，并略作改動(dòng)，采用化學(xué)共沉淀法，稱(chēng)取4.86 g FeCl3·6H2O和2.78 g FeSO4·7H2O溶于100 mL去離子水中，為防止磁性納米團(tuán)聚，再加一定量的PEG4000，超聲30 min除去體系中的氧氣，氮?dú)獗Ｗo(hù)下升溫至70 ℃，磁力攪拌下加入一定量的氨水，溶液逐漸變?yōu)楹谏磻?yīng)30 min后，用去離子水和無(wú)水乙醇反復(fù)洗滌，干燥，即得磁性Fe3O4納米粒子。

反應(yīng)原理：Fe2++2Fe3++8OH-1:→Fe3O4+4H2O。

1.2.2 磁性Fe3O4@SiO2納米粒子的制備

參照李進(jìn)紅等[20]的方法，并稍微改動(dòng)，取2 g磁性Fe3O4納米粒子溶于160 mL無(wú)水乙醇，40 mL去離子水，超聲處理30 min，磁力攪拌下加入5 mL氨水，再加緩慢加入5 mL正硅酸乙酯(TEOS)，40 ℃磁性攪拌8 h，磁性吸附，分別用無(wú)水乙醇和水反復(fù)洗滌，干燥，即得磁性Fe3O4@SiO2。

1.2.3 硅烷化Fe3O4@SiO2-NH2納米粒子的制備

取1 g磁性Fe3O4@SiO2，溶于100 mL甲苯中，超聲處理30 min，逐滴加入4 mL 3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)，磁力攪拌24 h，磁性吸附，分別用無(wú)水乙醇和水反復(fù)洗滌，干燥，即得磁性Fe3O4@SiO2-NH2。

1.2.4 表征方法

采用日本JEOL公司JEM-2100F型透射電鏡和德國(guó)Carl Zeiss公司Merlin compact型掃描電鏡對(duì)樣品進(jìn)行形貌結(jié)構(gòu)觀(guān)察；采用德國(guó)Bruker公司TENSOR2型傅里葉變換紅外光譜儀對(duì)樣品進(jìn)行表面性質(zhì)的表征；采用德國(guó)Bruker公司D8型X射線(xiàn)粉末衍射儀對(duì)磁性納米粒子進(jìn)行晶形結(jié)構(gòu)表征，CuKα射線(xiàn)(λ=0.15418 nm)，管電壓40 kV,管電流40 mA，掃描速率10°/min,掃描范圍5～80°;采用美國(guó)Lake Shore公司的VSM 7307型振動(dòng)樣品磁強(qiáng)計(jì)在室溫下對(duì)樣品進(jìn)行磁性能表征(磁滯曲線(xiàn)和飽和磁化強(qiáng)度)；采用美國(guó)TA公司TAQ600型熱重分析儀對(duì)樣品進(jìn)行熱穩(wěn)定性表征，氣氛為N2，溫度范圍在0～1 000℃，升溫速率為10 ℃/min；采用瑞士帝肯公司Infinite M200Pro型酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度

1.2.5 CGTase的固定化

準(zhǔn)確稱(chēng)取10 mg磁性納米粒子，分別加入一定濃度的CGTase酶液，酶液由一定pH值的緩沖液配制，在設(shè)定的溫度、設(shè)定轉(zhuǎn)速的搖床中固定化一定的時(shí)間。固定化結(jié)束后，把固定化好的CGTase用磁鐵分離，將上清液吸出，用一定的緩沖液反復(fù)洗滌至上清液酶蛋白含量為零。

(1)固定化酶的熱穩(wěn)定性

將游離酶和固定化酶分別置于4、10、20、30、40、50、60 ℃恒溫水浴條件下處理2 h，測(cè)定其酶活，以最高酶活力為100%，探究不同溫度對(duì)固定化酶和游離酶活力的影響。

(2)固定化酶的pH穩(wěn)定性

將游離酶和固定化酶分別置于50 mmol/L不同pH 4～12的緩沖液中處理2 h，測(cè)定其酶活，以最高酶活力為100%，探究不同pH對(duì)固定化酶和游離酶活力的影響。

(3)固定化酶的儲(chǔ)存穩(wěn)定性

將游離酶和固定化酶分別在4 ℃放置0、5、10、15、20、25、30 d，將第一次測(cè)得的酶活記為100%，探究其儲(chǔ)存穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 形貌表征

2.1.1 透射電子顯微鏡(TEM)

分別對(duì)Fe3O4，F(xiàn)e3O4@SiO2，F(xiàn)e3O4@SiO2-NH2的粒徑和形貌進(jìn)行透射電鏡表征，如圖1(a,b,c)所示，共沉淀法制得的磁性Fe3O4納米粒子平均粒徑為18 nm,形貌為球形且大小均勻。Fe3O4粒子被SiO2包覆后，其周?chē)袣?，使Fe3O4@SiO2粒徑增大，粒徑約22 nm。Fe3O4@SiO2氨基化后，粒徑無(wú)明顯變化。

圖1 Fe3O4, Fe3O4@SiO2和Fe3O4@SiO2-NH2的透射電鏡圖Fig 1 TEM images of Fe3O4, Fe3O4@SiO2 and Fe3O4@SiO2-NH2

2.1.2 掃描電子顯微鏡(SEM)

分別對(duì)Fe3O4，F(xiàn)e3O4@SiO2，F(xiàn)e3O4@SiO2-NH2的粒徑和形貌進(jìn)行掃描電鏡表征，如圖2(a,b,c)所示，3種納米粒子的掃描電鏡圖形狀較規(guī)則，均呈球狀。但未經(jīng)修飾的Fe3O4由于表面能高，團(tuán)聚較明顯。

圖2 (a)Fe3O4 ,(b)Fe3O4@SiO2和(c)Fe3O4@SiO2-NH2的掃描電鏡圖Fig 2 SEM images of Fe3O4, Fe3O4@SiO2 and Fe3O4@SiO2-NH2

2.2 紅外光譜分析

樣品Fe3O4，F(xiàn)e3O4@SiO2，F(xiàn)e3O4@SiO2-NH2等納米粒子的紅外光譜見(jiàn)圖3(a,b,c)，F(xiàn)e3O4納米粒子在580 cm-1處有吸收峰，是Fe-O特征伸縮振動(dòng)吸收峰。Fe3O4﹫SiO2納米粒子在797和1 090 cm-1處分別為Si-O-Si的對(duì)稱(chēng)和不對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)吸收峰，956和466 cm-1分別為Si-OH和Si-O-Si的彎曲振動(dòng)吸收峰，這表明Fe3O4納米粒子表面已生成了SiO2。Fe3O4﹫SiO2-NH2納米粒子在2 929 cm-1處為C—H反對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)吸收峰，1 490 cm-1為—CH2彎曲振動(dòng)吸收峰，1 560處為N—H變形振動(dòng)吸收峰，這表明Fe3O4﹫SiO2納米粒子表面已成功引入氨基。

圖3 Fe3O4, Fe3O4@SiO2和Fe3O4@SiO2-NH2的FT-IR譜圖Fig 3 FT-IR spectra of Fe3O4, Fe3O4@SiO2 and Fe3O4@SiO2-NH2

2.3 磁性納米粒子的X衍射分析

樣品Fe3O4，F(xiàn)e3O4@SiO2，F(xiàn)e3O4@SiO2-NH2等納米粒子的XRD見(jiàn)圖4(a,b,c)，由圖可知，F(xiàn)e3O4，F(xiàn)e3O4@SiO2，F(xiàn)e3O4@SiO2-NH2的衍射峰出現(xiàn)的位置2θ在30.07°、35.42°、43.05°、53.41°、56.93°、62.52°的衍射角依次對(duì)應(yīng)于反式尖晶石結(jié)構(gòu)Fe3O4的(220)、(311)、(400)、(422)、(511)、(440)晶面，這與Fe3O4標(biāo)準(zhǔn)卡片中相應(yīng)的特征峰一致。這說(shuō)明，在對(duì)Fe3O4磁性納米粒子進(jìn)行表面改性時(shí)，F(xiàn)e3O4晶體的結(jié)構(gòu)并未改變，峰形窄且尖銳，結(jié)晶完整，此外，F(xiàn)e3O4@SiO2，F(xiàn)e3O4@SiO2-NH2磁性納米粒子在2θ為20°～25°附近出現(xiàn)了衍射峰，強(qiáng)度不大，這與無(wú)定形二氧化硅的衍峰形一致。

圖4 Fe3O4, Fe3O4@SiO2和Fe3O4@SiO2-NH2的XRD譜圖Fig 4 XRD spectra of Fe3O4, Fe3O4@SiO2 and Fe3O4@SiO2-NH2

2.4 磁性納米粒子的磁性能分析

Fe3O4，F(xiàn)e3O4@SiO2，F(xiàn)e3O4@SiO2-NH2等納米粒子的磁滯回線(xiàn)見(jiàn)圖5(a、b、c)。由圖可知，這3種納米粒子剩余磁化強(qiáng)度和矯頑力均為零，且室溫下均表現(xiàn)出良好的超順磁性。Fe3O4納米粒子的飽和磁化強(qiáng)度為132.06 Am2/kg，與TEOS作用后，得到的Fe3O4@SiO2納米粒子的飽和磁化強(qiáng)度為60.67 Am2/kg， APTES與Fe3O4@SiO2納米粒子反應(yīng)后，得到Fe3O4@SiO2-NH2納米粒子的飽和磁化強(qiáng)度為40.22 Am2/kg。3種磁性粒子飽和磁化強(qiáng)度依次降低是因?yàn)榇判粤Ｗ颖砻姘擦朔谴判晕镔|(zhì)，粒子磁性成分降低。

圖5 Fe3O4, Fe3O4@SiO2和Fe3O4@SiO2-NH2的磁響應(yīng)曲線(xiàn)Fig 5 Magnetic response curves of Fe3O4, Fe3O4@SiO2 and Fe3O4@SiO2-NH2

圖6 Fe3O4@SiO2-NH2納米粒子經(jīng)磁場(chǎng)分離的示意圖Fig 6 Schematic diagram of magnetic field separation of Fe3O4@SiO2-NH2 nanoparticles without and with external magnetic field

2.5 熱重分析

Fe3O4，F(xiàn)e3O4@SiO2，F(xiàn)e3O4@SiO2-NH2等納米粒子的熱重分析見(jiàn)圖7(a、b、c)，3種納米粒子測(cè)定溫度均在室溫下測(cè)定。由圖7可知，F(xiàn)e3O4納米粒子熱穩(wěn)定性良好，與TEOS作用后，得到的Fe3O4@SiO2納米粒子失重約2.3%，用APTES與Fe3O4@SiO2納米粒子反應(yīng)后，得到Fe3O4@SiO2-NH2納米粒子失重約11%，修飾上的氨基含量約為3.5%。

圖7 Fe3O4, Fe3O4@SiO2和Fe3O4@SiO2-NH2的失重曲線(xiàn)Fig 7 Weight loss curves of Fe3O4, Fe3O4@SiO2 and Fe3O4@SiO2-NH2

2.6 固定化酶的熱穩(wěn)定性

結(jié)果如圖8，隨著溫度的不斷升高，固定化酶與游離酶的酶活均下降，但固定化酶的穩(wěn)定性?xún)?yōu)于游離酶，在60 ℃時(shí)，游離CGTase的酶活保留率僅為13.43%，而固定化CGTase在60 ℃保存2 h后，酶活保留率可達(dá)23.4%，這說(shuō)明CGTase經(jīng)Fe3O4@SiO2-NH2磁性納米粒子固定化后，熱穩(wěn)定性得到了提高。

圖8 溫度對(duì)固定化酶和游離酶穩(wěn)定性的影響Fig 8 Effect of temperature on the stability of immobilized and free enzymes

2.7 固定化酶的pH穩(wěn)定性

把固定化酶和游離酶置于pH 4-12條件下2 h，測(cè)定酶活力，研究pH對(duì)酶活力的影響。由圖9可得，在pH為9時(shí)，游離CGTase和固定化CGTase均有最高的穩(wěn)定性，且固定化CGTase對(duì)酸堿的耐受性?xún)?yōu)于游離酶，在pH為4～9時(shí)，隨著pH的不斷升高，固定化酶與游離酶的酶活均增大，在pH為9～12時(shí)，隨著pH的不斷升高，固定化酶與游離酶的酶活均下降。這說(shuō)明CGTase經(jīng)Fe3O4@SiO2-NH2磁性納米粒子固定化后，對(duì)酸堿的耐受性也得到了提高。

圖9 pH對(duì)固定化酶和游離酶穩(wěn)定性的影響Fig 9 Effect of pH on the stability of immobilized and free enzymes

2.8 固定化酶的儲(chǔ)存穩(wěn)定性

將游離CGTase和固定化CGTase在4 ℃下放置，每隔5天測(cè)定一次酶活，由圖10可知，固定化酶和游離酶的酶活保留率均隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，固定化CGTase放置30 d后，保留了61%的初始酶活，而游離CGTased的酶活保留率為50%相比于游離酶，固定化酶的酶活保留率降低的趨勢(shì)更緩慢。這說(shuō)明，固定化CGTase與游離CGTase相比，儲(chǔ)存穩(wěn)定性明顯提高。

圖10 固定化酶與游離酶的儲(chǔ)存穩(wěn)定性Fig 10 Storage stability of immobilized and free enzymes

3 結(jié) 論

采用共沉淀法制備Fe3O4納米粒子，并依次用TEOS、APTES對(duì)其進(jìn)行表面修飾，得到氨基硅烷化磁性納米粒子Fe3O4@SiO2-NH2。采用TEM、SEM、FTIR、XRD、VSM和TGA對(duì)磁性納米粒子進(jìn)行表征可得，F(xiàn)e3O4@SiO2-NH2納米粒子粒徑約為22 nm，結(jié)晶度高，穩(wěn)定性好，且具有良好的超順磁性。利用Fe3O4@SiO2-NH2納米粒子固定化CGTase可得，固定化酶的熱穩(wěn)定性，對(duì)酸堿的耐受性和儲(chǔ)存穩(wěn)定性均優(yōu)于游離酶。