鄧健康 劉亞青 王 碩，2*

（1 食品營養(yǎng)與安全國家重點實驗室 教育部食品營養(yǎng)與安全重點實驗室天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院 天津300457 2 天津市食品科學(xué)與健康重點實驗室 南開大學(xué)醫(yī)學(xué)院 天津300071）

近年來，構(gòu)建食品相關(guān)目標物的生物傳感器引起研究者的廣泛興趣。由于過氧化氫（Hydrogen peroxide，H2O2）的滅菌功能，常被用作包裝材料的消毒劑[1]。葡萄糖天然存在于或人工添加至各種食物基質(zhì)中。分析葡萄糖含量對于食品質(zhì)量控制、食品鑒偽有一定意義[2]。測定過氧化氫和葡萄糖含量在食品工業(yè)中具有重要的實際意義[3]。監(jiān)測血液和飲食中的葡萄糖含量對于預(yù)防或延緩糖尿病及其并發(fā)癥（如心臟病、血管疾病和血液循環(huán)不良、失明、腎功能衰竭、愈合不良、中風(fēng)等）的發(fā)生至關(guān)重要[4]。目前，學(xué)者們開發(fā)了多種方法檢測過氧化氫和葡萄糖，包括電化學(xué)方法[5]、高效液相色譜法[6]和表面等離子體共振法[7]。然而，上述方法存在耗時長，需要復(fù)雜的操作和昂貴的設(shè)備等不足。比色法具有靈敏度高，操作簡單，速度快等特點，在微量物質(zhì)檢測方面具有明顯優(yōu)勢。

銀納米顆粒 （Silver nanoparticles，AgNPs）是重要的金屬納米材料，在催化、抗菌和分析等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。由于AgNPs 易氧化和聚集，因此需加入穩(wěn)定劑（如聚合物、有機小分子和納米顆粒等）使其穩(wěn)定存在[8]。DNA 保護的金屬納米材料已應(yīng)用于很多領(lǐng)域?；谀承┙饘訇栯x子與DNA 的相互作用，其可作為合成金屬納米材料的模板[9]。DNA 特別是富含胞嘧啶的DNA 鏈對銀離子具有高親和力。利用不同的DNA 序列和還原劑，金屬離子可被還原成不同的金屬納米材料，如銀納米簇[10]、納米顆粒[11]和納米環(huán)[12]。

在氧氣存在時，葡萄糖氧化酶（Glucose oxidase，GOx）對葡萄糖具有高選擇性，可催化葡萄糖氧化生成過氧化氫[13-14]?；诖嗽?，研究者們開發(fā)了許多葡萄糖傳感器用于食品和飲料工業(yè)[15]。然而，僅有少數(shù)基于銀納米顆粒的比色傳感器用于檢測過氧化氫和葡萄糖。本研究中，建立了一種基于DNA-AgNPs 的比色傳感器，用于高靈敏檢測過氧化氫和葡萄糖。在DNA 保護下，用硼氫化鈉（NaBH4）還原硝酸銀（AgNO3）合成DNA-Ag-NPs。加入過氧化氫后DNA-AgNPs 顏色由黃褐色變?yōu)闊o色，從而實現(xiàn)過氧化氫的比色法檢測。在葡萄糖氧化酶作用下，間接測定葡萄糖的含量。為食品中過氧化氫和葡萄糖的檢測提供新方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

過氧化氫、硝酸銀、硝酸、果糖、蔗糖、麥芽糖、半乳糖，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；三羥甲基氨基甲烷（Tris）、硼氫化鈉，美國Sigma-Aldrich 公司；葡萄糖氧化酶（GOx），北京索萊寶科技有限公司；DNA：GGTATCTAGTTGAGCTGTCTAGTC；HPLC純化，上海生工生物工程股份有限公司。試劑均為分析純級，試驗用水為超純水（＞18.25 MΩ·cm）。

1.2 設(shè)備與儀器

5804R 高速離心機，德國Eppendorf 公司；Milli-Q 超純水系統(tǒng)，美國Millipore 公司；MX-S可調(diào)式漩渦混合器，美國SCILOGEX 公司；MB-102 恒溫振蕩金屬浴，加拿大Thermocell 公司；EV300 紫外-可見光分光光度計，美國Thermo Scientific 公司；雷磁PHS-3G pH 計，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；Hitachi-600 透射電子顯微鏡，日本Hitachi 公司；Alliance Waters 2695 高效液相色譜儀（配Waters 2414 示差檢測器），美國Waters 公司。

1.3 DNA-AgNPs 的合成

DNA-AgNPs 的合成參照Wu 等[16]的方法，并稍作修改。將AgNO3與DNA 溶液混合后劇烈搖動用NaBH4還原合成AgNPs。將100 μL ssDNA溶液（50 μmol/L）與390 μL Tris-HNO3（10 mmol/L，pH 7.0）和AgNO3溶液混合，旋渦混合1 min。在冰中孵育30 min 后，加入新鮮制備的NaBH4溶液，劇烈振蕩混合物1 min。DNA/AgNO3/NaBH4的摩爾濃度比為1/30/40。溶液在4 ℃避光反應(yīng)2 h。向混合溶液中加入Tris-HNO3（10 mmol/L，pH 7.0）緩沖液至終體積為3 mL。

合成時加入不同pH 值的Tris-HNO3緩沖液，研究不同pH 緩沖液對合成DNA-AgNPs 的影響。pH 范圍為4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0。其余合成條件同上。

1.4 優(yōu)化反應(yīng)時間

固定DNA-AgNPs 濃度為140 nmol/L，添加25 μmol/L H2O2或200 μmol/L 葡萄糖或0.1 mg/mL 葡萄糖氧化酶，37 ℃下避光反應(yīng)不同時間，研究不同反應(yīng)時間DNA-AgNPs 的變化。測定紫外-可見光光譜，光譜范圍為300～600 nm。

1.5 檢測緩沖液中的H2O2 和葡萄糖

固定DNA-AgNPs 濃度為140 nmol/L，加入不同濃度H2O2或葡萄糖/GOx （GOx：0.1 mg/mL），用Tris-HNO3（10 mmol/L，pH 7.0）緩沖液定容至200 μL，37 ℃下避光反應(yīng)75 min。測定紫外-可見光光譜，光譜范圍為300～600 nm。

1.6 檢測方法的特異性研究

為評價該方法對于檢測葡萄糖的選擇性，選擇了4 種單糖和二糖（包括果糖、蔗糖、麥芽糖和半乳糖），濃度均為200 μmol/L，根據(jù)1.5 節(jié)所述試驗步驟進行檢測。

1.7 檢測梨汁樣品中的葡萄糖

1.7.1 HPLC 法檢測梨汁中原始葡萄糖含量 HPLC條件參照Ma 等[6]的方法，并稍作修改。將梨汁用0.22 μm 針管過濾器過濾，并用水（50%）/乙腈（50%）稀釋。使用Waters e2695 高效液相色譜儀，配制2414 示差檢測器，色譜柱為Agilent ZORBAX 碳水化合物分析柱（5 μm，4.6 mm×150 mm）。色譜條件∶流動相為水∶乙腈=25∶75 （體積比），等度洗脫，流速為1.5 mL/min，色譜柱溫度為30 ℃，進樣體積為10 μL，以保留時間定性，外標法定量。

1.7.2 加標回收試驗 為測試該方法在實際樣品中的檢測性能，選擇從當?shù)爻匈彽玫睦嬷?。添加濃度?0，50，100 μmol/L。按照1.5 節(jié)的試驗條件對葡萄糖含量進行檢測。重復(fù)測定3 次取平均值。

1.8 材料表征

通過掃描透射電鏡（TEM）表征DNA-AgNPs的形貌和尺寸。將DNA-AgNPs 滴涂在超薄碳膜上，自然晾干后檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 材料表征

通過TEM 和紫外-可見光吸收光譜對DNAAgNPs 的形貌、尺寸和光學(xué)性質(zhì)進行研究。DNAAgNPs 是AgNO3在DNA 保護下由NaBH4還原而成。在沒有DNA 保護的情況下 （即DNA/AgNO3/NaBH4比例為0/30/40，摩爾濃度比），AgNPs 在制備后立即沉淀（圖1a）。在DNA 保護下，形成均勻穩(wěn)定的DNA-AgNPs 棕褐色溶液（圖1b），并在黑暗條件下保持穩(wěn)定幾個月。在pH 7.0 時合成的DNA-AgNPs 的吸收峰位于424 nm （圖2），DNAAgNPs 的紫外-可見光吸收特性與前人報道基本一致[11，16]。DNA-AgNPs 吸收峰尖銳，材料顏色呈黃褐色。如圖3，TEM 結(jié)果表明合成的DNA-AgNPs單分散性良好。圖3嵌入圖像是200 個納米顆粒的粒度分布直方圖。經(jīng)統(tǒng)計，DNA-AgNPs 粒徑為（3.83±1.11）nm（圖3）。

固定DNA/AgNO3/NaBH4比例為1/30/40 （摩爾濃度比），在pH 4.0～10.0 條件下合成DNA-Ag-NPs，如圖2所示，不同pH 值下DNA-AgNPs 的吸收峰峰型和強度差異都很小，結(jié)果表明，pH 值對DNA-AgNPs 的紫外-可見光光譜影響很小。為保證后續(xù)試驗葡萄糖氧化酶的活性，選擇pH 7.0 為最優(yōu)的合成和后續(xù)試驗反應(yīng)條件。

2.2 檢測原理

圖4描述了該方法的工作原理。加入過氧化氫后DNA-AgNPs 被刻蝕成銀離子，溶液顏色由黃褐色變?yōu)闊o色，從而實現(xiàn)過氧化氫的比色法檢測。在氧氣存在時，葡萄糖氧化酶可以催化葡萄糖氧化形成過氧化氫和葡萄糖酸，可以間接測定葡萄糖含量[17-18]。

圖1 不存在（a）或存在（b）DNA 保護時合成的AgNPsFig.1 Image of composed AgNPs without （a） and with （b） DNA protection

圖2 不同pH 緩沖液中合成DNA-AgNPs 的紫外-可見光吸收光譜圖Fig.2 The absorption spectra of composed DNA-AgNPs in Tris-HNO3 buffer of different pH

圖3 DNA-AgNPs 的TEM 圖Fig.3 TEM images of the DNA-AgNPs

圖4 比色法檢測過氧化氫和葡萄糖Fig.4 Detection of H2O2 and glucose by label-free colorimetric assay

如圖5所示，相對于圖5a 的原始DNA-Ag-NPs，單獨加入葡萄糖氧化酶或葡萄糖存在時（圖5b，5c），溶液吸光度無變化。在添加100 μmol/L H2O2情況下，DNA-AgNPs 在424 nm 處的紫外-可見吸收峰強度降低（圖5e）。添加200 μmol/L 葡萄糖和0.1 mg/mL 的葡萄糖氧化酶，觀察到同樣的現(xiàn)象（圖5d），證明生成了H2O2。在加入H2O2后觀察到紫外-可見吸收峰逐漸紅移，這表明AgNPs 的平均尺寸增加。

為驗證以DNA 為模板合成的AgNPs 在本檢測體系中的優(yōu)越性，根據(jù)Qin 等[19]的方法合成了檸檬酸保護的AgNPs，即citrate-AgNPs。調(diào)整citrate-AgNPs 濃度至吸光度和DNA-AgNPs 相等時，添加100 μmol/L H2O2，發(fā)現(xiàn)citrate-AgNPs（圖6a）對H2O2幾乎無響應(yīng)（圖6b），而DNA-AgNPs的吸光度降低超過90%（圖6c，6d）。上述結(jié)果說明DNA-AgNPs 用于本方法可以獲得更高的靈敏度。

H2O2可以根據(jù)以下反應(yīng)的刻蝕溶解金屬銀[20]：使用透射電子顯微鏡研究了添加不同濃度H2O2時DNA-AgNPs 的形態(tài)變化。TEM 圖像表明，在10 μmol/L H2O2存在時，球形DNA-AgNPs 納米顆粒被蝕刻成更小的粒子（圖7a），同時發(fā)現(xiàn)蝕刻過程與H2O2濃度有關(guān)，這與已報道的研究結(jié)果類似[21-22]。在100 μmol/L H2O2存在下，觀察到銀顆粒的聚集體（圖7b），這可能由于在高濃度銀離子的條件下，發(fā)生了鹽誘導(dǎo)的AgNPs 聚集[23]。TEM 的結(jié)果與其紫外吸收響應(yīng)數(shù)據(jù)相一致，基于此，可以通過監(jiān)測DNA-AgNPs 的吸光度變化來檢測H2O2和葡萄糖。

圖5 不同組分存在下DNA-AgNPs（a）的吸收光譜：葡萄糖氧化酶（b）；葡萄糖（c）；葡萄糖氧化酶/葡萄糖（d）；H2O2（e）Fig.5 Absorbance of DNA-AgNPs （a） in the presence of GOx （b）, glucose （c）, GOx/glucose （d）, H2O2 （e）

圖6 添加100 μmol/L H2O2 對citrate-AgNPs（a，b）和DNA-AgNPs（c，d）吸光度影響Fig.6 Comparison of the effect of 100 μmol/L H2O2 on citrate-AgNPs （a，b） and DNA-AgNPs （c，d）

圖7 加入10 μmol/L（a）或100 μmol/L（b）H2O2 后的DNA-AgNPs 的TEM 圖像Fig.7 TEM images of the DNA-AgNPs after addition of 10 μmol/L （a），100 μmol/L （b） H2O2

2.3 最優(yōu)反應(yīng)時間

有研究表明，孵育時間對過氧化氫刻蝕金屬納米顆粒的程度有重要影響[24]。如圖8所示，加入H2O2或葡萄糖氧化酶/葡萄糖后，隨著孵育時間的延長，吸光度下降，并且在75 min 后變化不明顯。因此，選擇75 min 作為檢測H2O2或葡萄糖氧化酶/葡萄糖的反應(yīng)時間。

2.4 檢測方法靈敏度

圖8 不同反應(yīng)時間對DNA-AgNPs 吸光度變化的影響Fig.8 Effects of incubation time on the absorbance of DNA-AgNPs

為進一步探明本方法的分析性能，研究其對過氧化氫和葡萄糖的線性檢測范圍及檢出限。DNA-AgNPs 在424nm 波長處的吸收峰強度（A424nm）隨著H2O2（圖9）或葡萄糖（圖10）濃度的增加而逐漸降低。對應(yīng)的顏色由黃褐色逐漸變?yōu)闇\黃色最終變?yōu)闊o色。吸光值與H2O2濃度在1～20 μmol/L范圍內(nèi)表現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，線性方程為Y=-0.0301X+0.8661，其中Y 為吸光值，X 為H2O2濃度（μmol/L），相關(guān)系數(shù)R2=0.992，基于S/N=3 計算得出H2O2檢出限為0.36 μmol/L。對于葡萄糖檢測，吸光值與葡萄糖濃度在10～50 μmol/L 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性方程為Y=-0.00785X+0.8495，其中Y 為吸光值，X 為葡萄糖濃度（μmol/L），相關(guān)系數(shù)R2=0.997，檢出限為1.13 μmol/L。上述結(jié)果表明，該方法利用比色法可以檢測H2O2和葡萄糖，線性關(guān)系良好，靈敏度較高。

圖9 DNA-AgNPs 在不同濃度H2O2 存在時的紫外-可見光吸收光譜Fig.9 The absorption spectra of DNA-AgNPs with H2O2 at different concentrations

圖10 日光下傳感體系顏色隨H2O2 濃度的變化Fig.10 The image of the sensing system under visible light with H2O2 at different concentrations

圖11 A424nm 隨H2O2 濃度不同的變化曲線（a）及線性關(guān)系曲線（b）Fig.11 The relationship between the A424nm and the concentrations of H2O2

圖12 DNA-AgNPs 在不同濃度葡萄糖存在時的紫外-可見光吸收光譜Fig.12 The absorption spectra of the sensing system under visible light with glucose at different concentrations

圖13 日光下傳感體系顏色隨葡萄糖濃度的變化Fig.13 The image of the sensing system under visible light with glucose at different concentrations

圖14 A424nm 隨葡萄糖濃度不同的變化曲線及線性關(guān)系曲線Fig.14 The relationship between the A424nm and the concentrations of glucose

2.5 選擇性

為評價該方法對于檢測葡萄糖的選擇性，選擇4 種單糖和二糖（包括果糖、蔗糖、麥芽糖和半乳糖，濃度均為200 μmol/L），利用比色法進行檢測。如圖15所示，添加4 種干擾物質(zhì)后，溶液吸光度沒有明顯下降，加入葡萄糖后吸光度顯著降低。結(jié)果表明本方法對葡萄糖具有高度選擇性，并且葡萄糖的檢測可以通過可見光下顏色變化來進行可視化檢測。

2.6 實際樣品檢測

以梨汁為實際樣品，經(jīng)高效液相色譜法測定，梨汁中原始的葡萄糖含量為（15±0.13）mg/mL。通過在梨汁中加入不同濃度的葡萄糖，在最優(yōu)條件下測定其回收率。加標樣品的回收率范圍從87.00%～96.02%（見表1），表明該方法在實際樣品中檢測葡萄糖含量具有潛在的實用性。

圖15 選擇性驗證結(jié)果Fig.15 The results of selectivity tests

表1 在梨汁樣品中檢測葡萄糖回收率試驗Table 1 Recovery of glucose in pear juice samples

3 結(jié)論

建立了一種基于DNA-AgNPs 的比色傳感器，用于高靈敏度檢測過氧化氫和葡萄糖。在DNA 保護下，用硼氫化鈉還原硝酸銀合成DNAAgNPs。加入過氧化氫后DNA-AgNPs 顏色由黃褐色變?yōu)闊o色，從而實現(xiàn)過氧化氫的比色法檢測。與citrate-AgNPs 相比，DNA-AgNPs 對過氧化氫響應(yīng)更靈敏。在葡萄糖氧化酶輔助下，間接測定了葡萄糖的含量。通過在梨汁中加入不同濃度的葡萄糖，采用比色法測定其回收率，結(jié)果表明該方法可以用于實際樣品中的葡萄糖檢測，具有優(yōu)異的檢測特異性。該方法實現(xiàn)了食品中目標物的快速、可視化檢測，具有易制備，操作簡單，消耗低等優(yōu)勢，為構(gòu)建食品中目標物的檢測方法提供了有益參考。