王 耀 李燕虹 吳佳蓓 邢云瑞 曹金博 陳秀金 李兆周 鄧瑞廣 胡驍飛*

（1 河南科技大學食品與生物工程學院 食品加工與安全國家級實驗教學示范中心 河南洛陽471023 2 河南省農業(yè)科學院 河南省動物免疫學重點實驗室 鄭州450002）

大豆富含蛋白質、脂肪和碳水化合物等物質，可為機體提供豐富的營養(yǎng)，是非常重要的食用蛋白、油脂及飼料來源[1]。大豆中也存在一些致敏蛋白和抗營養(yǎng)因子 （Antinutritional factors，ANF）[2]，胰蛋白酶抑制因子（Trypisin inhibitor，TI）是其中重要的一類。TI 可引發(fā)過敏反應，也可抑制胰蛋白酶和糜蛋白酶活性，影響消化吸收，阻礙機體生長[3-4]。TI 主要包括2 種類型[5]：一種是Kunitz 胰蛋白酶抑制因子 （Kunitz trypsin inhibitor，KTI），分子質量為20～25 ku，主要作用于胰蛋白酶，可與胰蛋白酶等比例結合，不溶于乙醇，對熱和酸較敏感，易失活[6]；另一種是Bowman-Birk 胰蛋白酶抑制因子（Bowman-Birk inhibitor，BBI），分子質量為6～10 ku，含有2 個獨立的活性中心，又稱為雙頭抑制因子，可與胰蛋白酶或糜蛋白酶等比例結合或與兩種酶同時結合[7]，不溶于丙酮，耐熱和酸且不易被酶水解，相比KTI 較為穩(wěn)定[8-9]。傳統(tǒng)檢測TI 的方法屬于酶化學分析法，其在靈敏度和穩(wěn)定性方面存在不足，且檢測結果無法區(qū)分TI 的具體類型[10]。酶聯(lián)免疫吸附試驗（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA） 可通過特異性抗體準確識別TI，快速、靈敏分析，是近年來TI 檢測方法研究的主要方向之一[11]。該方法應用于KTI 檢測的研究報道較多[12-14]，而針對BBI 檢測的此類研究相對缺乏。本試驗旨在通過動物免疫和細胞融合，篩選制備親和力高、敏感性好、特異性強的BBI 單克隆抗體（Monoclonal antibody，mAb），為ELISA等免疫學檢測方法的建立提供良好的抗體基礎，進而對食品及飼料中大豆致敏蛋白和抗營養(yǎng)因子的高效檢測起到技術依據。

1 材料與方法

1.1 試劑

大豆球蛋白（Glycinin）、β-伴大豆球蛋白（βconglycinin）、大豆凝集素（Soybean agglutinin，SBA）、BBI、KTI、鼠源mAb 分型試劑、弗氏完全佐劑及不完全佐劑（FCA/FIC），美國Sigma-Aldrich公司；HAT、HT、RPMI-1640 培養(yǎng)基、胎牛血清、NC膜、預染蛋白Marker、羊抗鼠二抗 （GaMIgGHRP），索萊寶生物科技公司；Na2HPO4·12H2O，KH2PO4，NaCl，KCl，NaHCO3等常用試劑為分析純級，國藥集團化學試劑有限公司，用于配制ELISA包被液（CBS）、稀釋液（PBS）等緩沖液。

1.2 實驗動物及骨髓瘤細胞

無特定病原體（SPF）級雌性BALB/c 小鼠（6～8 周齡）用于動物免疫和腹水制備。NS0 骨髓瘤細胞用于細胞融合。

1.3 動物免疫及多抗鑒定

采用背部皮下多點注射，將BBI 以50 μg/只的劑量免疫BALB/c 小鼠4 只。首次以FCA 等量混合免疫，間隔3 周，以FIA 等量混合加強免疫，共免疫4 次。免疫完成后采血，采用間接ELISA 試驗測定多抗血清效價，采用間接競爭ELISA 試驗鑒定多抗血清敏感性[15]。通過間接ELISA 試驗測定陽性孔OD450nm（P）與陰性孔OD450nm（N）的比值，以P/N≥2.1 判定效價。采用間接競爭ELISA 試驗測得抑制曲線，計算半數(shù)抑制濃度（IC50）衡量敏感性。

1.4 雜交瘤細胞株的建立

選擇多抗效價高、敏感性較優(yōu)的小鼠作為超免小鼠進行細胞融合[16]。將小鼠脾細胞與骨髓瘤細胞融合后的細胞懸液加入細胞培養(yǎng)板，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)約1 周后用HT 培養(yǎng)基半量換液。根據細胞生長狀態(tài)，在培養(yǎng)約10 d 時取上清液，采用間接ELISA 和間接競爭ELISA 試驗篩選上清效價及敏感性良好的陽性孔，采用有限稀釋法將細胞生長旺盛的陽性孔亞克隆[17]，采用ELISA 試驗重復篩選，以獲得穩(wěn)定分泌抗體的雜交瘤細胞株。

1.5 BBI mAb 大量制備

采用體內誘生腹水法制備BBI mAb，液體石蠟以0.5 mL/只的劑量腹腔注射BALB/c 小鼠，10 d 后腹腔注射已擴大培養(yǎng)的陽性雜交瘤細胞 （約106個）。觀察到小鼠腹部顯著腫脹時進行腹水采集，在5 000 r/min 條件下離心10 min 去除雜質，通過飽和硫酸銨法純化獲得BBI mAb[18]。

1.6 BBI mAb 免疫學特性鑒定

通過效價、亞型、親和常數(shù)、敏感性和特異性等5 個方面指標對BBI mAb 的免疫學特性進行鑒定。BBI mAb 的效價采用間接ELISA 試驗測定。亞型通過Sigma 鼠源mAb 分型試劑并采用間接ELISA 方法鑒定[19]。親和常數(shù)（Ka）通過ELISA飽和法測定[20]，采用間接ELISA 試驗測定不同包被質量濃度（[Ag]t、[Ag’]t）時抗體結合抗原半飽和對應的質量濃度（[Ab]t、[Ab’]t），依據Ka=（n-1）/2（n[Ab’]t-[Ab]t）計算，式中n=[Ag]t/[Ag’]t。敏感性通過間接競爭ELISA 試驗建立抑制曲線并計算IC50進行衡量。特異性通過測定mAb 與其它大豆致敏蛋白和抗營養(yǎng)因子 （Glycinin、β-conglycinin、SBA、KTI） 的交叉反應以及Western blot 試驗鑒定。交叉反應以間接競爭ELISA 試驗所得交叉反應率（CR/%=BBI 的IC50/其它競爭物的IC50）衡量[21]；Western blot 試驗同樣利用其它大豆致敏蛋白和抗營養(yǎng)因子進行，聚丙烯酰胺凝膠電泳 （SDSPAGE）試驗做一次重復，電泳后一份用于染色，另一份用于Western blot 試驗轉膜，轉膜后先與mAb 反應，經洗滌后再與GaMIgG-HRP 反應，最后經ECL 熒光顯色，并與電泳結果對比[22]。

2 結果與分析

2.1 多抗血清的鑒定

小鼠多抗血清效價測定所得OD450nm值 （3 次試驗平均值）如表1所示。4 只小鼠經免疫后均產生了抗體，其中1 號小鼠免疫效果最好，多抗血清效價能夠達到1∶12 800 以上，2 號和3 號小鼠多抗血清的效價均能夠達到1∶6 400 以上，4 號小鼠可能因操作不當或小鼠個體差異使其免疫效果欠佳。

表1 多抗血清效價測定所得OD450nm 值Table 1 The value of OD450nm obtained from the determination of antiserum titer

將1 號、2 號和3 號小鼠多抗血清分別進行間接競爭ELISA 試驗鑒定其敏感性。通過計算抑制率 （B/B0，B 為BBI 不同質量濃度的OD450nm值，B0為BBI 零濃度的OD450nm值），并與BBI 質量濃度的對數(shù)值繪制抑制曲線。BBI 對3 只小鼠多抗血清均產生了抑制，其中對1 號小鼠多抗血清效果明顯，其抑制曲線如圖1所示，線性回歸方程為y=-0.2239x+1.158，R2=0.9802，計算可得1 號小鼠多抗血清IC50為868.58 ng/mL。

2.2 BBI mAb 的制備

選擇1 號小鼠進行細胞融合，通過間接ELISA 和間接競爭ELISA 試驗對細胞培養(yǎng)上清液進行檢測。將首次篩選出的強陽性細胞轉孔培養(yǎng)并亞克隆，最終篩選出5 株效價高、敏感性好的雜交瘤細胞，分別命名為2E1-F3，3B7-B10，7G7-D11，8D11-B2，10B2-C8，5 株細胞經過多次凍存與復蘇后，仍能夠穩(wěn)定分泌抗體。其中3B7-B10細胞上清效價最高，敏感性最好，通過小鼠體內誘生腹水法得到3B7-B10 腹水后純化制備BBI mAb。

圖1 1 號小鼠多抗血清的間接競爭ELISA 抑制曲線Fig.1 Indirect competitive ELISA inhibition curve of NO.1 antiserum

2.3 BBI mAb 效價的測定

mAb 效價測定所得OD450nm值如表2所示，表中3 次重復試驗測得mAb 效價一致，均能夠達到1∶4.096×105以上，相比小鼠多抗血清以及融合細胞培養(yǎng)上清有很大幅度提高。

表2 mAb 效價測定所得OD450nm 值Table 2 The value of OD450nm obtained from the determination of mAb titer

2.4 BBI mAb 亞型的鑒定

將mAb 包被ELISA 酶標板，采用mAb 分型試劑，通過間接ELISA 試驗，獲得不同分型試劑對應的OD450nm值。如圖2所示，IgG1 分型試劑對應的OD450nm值顯著大于其它分型試劑對應的OD450nm值，表明mAb 的亞型為IgG1 型。

圖2 mAb 亞型鑒定Fig.2 Identification of subtype of mAb

2.5 BBI mAb 親和常數(shù)的測定

通過ELISA 飽和法繪制分別包被5 μg/mL 和1 μg/mL BBI 時mAb 與其結合的親和常數(shù)曲線。如圖3所示，以曲線頂端平緩處為結合飽和狀態(tài)，得到BBI 在5 μg/mL 和1 μg/mL 包被時，mAb 與其結合的半飽和質量濃度分別為1051.82 ng/mL和774.5 ng/mL。根據親和常數(shù)計算公式可得Ka=1.13×108L/mol，處于高親和力抗體的Ka 范圍（107～1012L/mol）[23]，表明試驗所制備的mAb 具有較高的親和力。

2.6 BBI mAb 敏感性的鑒定

間接競爭ELISA 鑒定敏感性所繪的mAb 抑制曲線如圖4所示。線性回歸方程為y=-0.5138x+1.4862，R2=0.973，計算可得mAb 的IC50值為83.07 ng/mL，表明mAb 具有良好的敏感性，且相比多抗血清，敏感性顯著提高。

圖3 mAb 親和常數(shù)測定曲線Fig.3 Affinity constant measurement curve of mAb

圖4 BBI 對3B7-B10 mAb 的抑制曲線Fig.4 Inhibitive curve for 3B7-B10 mAb to BBI

2.7 BBI mAb 特異性的鑒定

采用間接競爭ELISA 方法測定mAb 的交叉反應試驗結果如表3所示，mAb 與其它大豆致敏蛋白和抗營養(yǎng)因子的交叉反應率均小于1%，可判定為無交叉反應。

特異性鑒定結果如圖5和圖6所示，圖5為3B7-B10 細胞上清的特異性鑒定結果，圖6為腹水所得3B7-B10 mAb 特異性鑒定結果。圖5和圖6中a 圖均為SDS-PAGE 試驗結果，b 圖均 為Western blot 試驗結果。圖5中a、b 圖對比顯示細胞上清可與第3 泳道的BBI 結合，證明細胞培養(yǎng)產生的抗體特異性良好。圖6中a、b 圖對比顯示mAb 僅與第5 泳道的BBI 結合，表明試驗制備的mAb 特異性強。

表3 mAb 的交叉反應試驗結果Table 3 The cross-reactivity test results of mAb

圖5 細胞上清特異性鑒定Fig.5 Specificity identification of cellular supernatant

3 結論

圖6 mAb 特異性鑒定Fig.6 Specificity identification of mAb

本試驗通過BBI 免疫BALB/c 小鼠，在鑒定小鼠多抗血清效價和敏感性的基礎上，選擇效價和敏感性較優(yōu)的小鼠進行細胞融合，成功篩選得到分泌BBI 單克隆抗體的穩(wěn)定雜交瘤細胞株，并采用體內誘生腹水法制備BBI mAb，其中3B7-B10 mAb 效價達到1∶4.096×105以上，亞型為IgG1 型，IC50為83.07 ng/mL，具有較高的親和力且特異性強，說明所制備的mAb 免疫學特性良好，為建立大豆及其制品中BBI 的免疫學檢測方法提供良好的抗體基礎。