許 女 李雅茹 王超宇 張 浩 王如福

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 山西太谷030801）

細(xì)菌耐藥性問題愈加嚴(yán)峻，已成為威脅全球性公共衛(wèi)生的主要問題。長期以來，國內(nèi)外科研人員的研究重點(diǎn)在于臨床致病菌的耐藥性方面，而對(duì)非致病菌耐藥性的研究和報(bào)道較少。近年來，研究焦點(diǎn)逐步轉(zhuǎn)向以食物鏈為媒介的抗性基因的產(chǎn)生和傳播上。乳酸菌是很多發(fā)酵制品中的重要菌株，一直被認(rèn)為是安全的。然而，由于抗生素的不正當(dāng)使用，越來越多的乳酸菌具有耐藥性或者攜帶耐藥基因，大部分耐藥基因位于可移動(dòng)的非染色體遺傳因子上，包括質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子、整合子-基因盒系統(tǒng)、噬菌體等，可通過水平轉(zhuǎn)移進(jìn)而傳遞給其它腸道菌株，甚至是致病菌，導(dǎo)致超級(jí)細(xì)菌的產(chǎn)生，增加抗生素治療的失敗率，給人類的健康帶來嚴(yán)重的危害。

目前對(duì)于乳酸菌的耐藥性還沒有開展系統(tǒng)性研究，主要集中在動(dòng)物源[1]、乳及乳制品[2-4]中的分離菌株，而關(guān)于傳統(tǒng)發(fā)酵食品，如發(fā)酵肉類[5]、泡菜[6]、醋、酒及益生菌制劑[7]中乳酸菌的耐藥性研究較少。本文主要研究山西老陳醋醋醅、農(nóng)家發(fā)酵泡菜和發(fā)酵乳制品中乳酸菌的耐藥表型和基因型，對(duì)乳酸菌耐藥機(jī)制、傳播機(jī)理的研究提供支持，對(duì)保證食品安全具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

發(fā)酵乳制品，西藏、內(nèi)蒙地區(qū)農(nóng)家發(fā)酵乳制品；泡菜汁，四川地區(qū)農(nóng)家泡菜；醋醅，山西紫林醋業(yè)股份有限公司。

乳酸菌分離、培養(yǎng)MRS，M17 肉湯/瓊脂培養(yǎng)基，北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；細(xì)菌提基因組試劑盒，北京博邁德科技發(fā)展有限公司；Taq DNA聚合酶、dNTP、10×聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase chain reaction，PCR） 反應(yīng)緩沖液、10×Loading Buffer，大連寶生物工程有限公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

Veriti PCR 擴(kuò)增儀，美國ABI 公司；電泳成套設(shè)備，美國Bio-rad 公司；凝膠成像系統(tǒng)，美國Alpha Innotech 公司；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，美國Sigma 公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 菌株的分離與鑒定 將樣品用生理鹽水稀釋到10-7～10-9CFU/mL，吸取100 μL 置于加有0.04%溴甲酚紫的MRS 和M17 培養(yǎng)基平板上，37 ℃培養(yǎng)48 h，挑取單個(gè)產(chǎn)酸菌落進(jìn)行生理生化和16S rDNA 菌種鑒定。

1.3.2 菌株的耐藥表型檢測(cè) 按照美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)（CLSI）（2008）所推薦的MIC 法進(jìn)行藥物敏感性檢測(cè)，質(zhì)控菌株為金黃色葡萄球菌ATCC29213，所用抗生素均購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所或中國藥品與生物制品檢定所。

1.3.3 耐藥基因的PCR 擴(kuò)增 參考文獻(xiàn)[8-9]等的引物序列，采用PCR 方法對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類、林可胺類、四環(huán)素類和β-內(nèi)酰胺類等耐藥基因進(jìn)行檢測(cè)，引物序列及擴(kuò)增片段長度見表1。

1.3.4 生物被膜檢測(cè)

1.3.4.1 微量滴定板法（MTP） 過夜培養(yǎng)的乳酸菌菌株，調(diào)整菌懸液濃度為1.5×108CFU/mL，經(jīng)TSB 1∶100 稀釋后加到96 孔平底組織培養(yǎng)孔中，每孔加入200 μL，每株菌做3 個(gè)平行孔。以不接菌的TSB 培養(yǎng)基作為陰性對(duì)照，37 ℃培養(yǎng)24 h。輕棄上清，用PBS 緩沖液洗滌3 次后，60 ℃，干燥固定1 h，然后用1%的結(jié)晶紫染色1 min，蒸餾水沖洗后，加入200 μL 95%乙醇，待粘附在孔底的生物被膜菌全部溶解后，于570 nm 波長處測(cè)OD值。

ODc= 陰性對(duì)照樣品的平均OD 值+3×SD（標(biāo)準(zhǔn)差）

不產(chǎn)生物被膜的菌株：OD ≤ODc；

產(chǎn)生物被膜能力較弱的菌株：ODc ＜OD ≤2×ODc；

產(chǎn)生物被膜能力適中的菌株：2 × ODc ＜OD≤4×ODc；

產(chǎn)生物被膜能力較強(qiáng)的菌株：4×ODc ＜OD

2 結(jié)果與討論

2.1 傳統(tǒng)發(fā)酵食品中乳酸菌的分離與鑒定

共分離鑒定出乳酸菌菌株97 株，具體分布如圖1所示，并對(duì)典型分離菌株進(jìn)行了16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建（圖2）。醋醅中乳酸菌的種類較豐富，共分離菌株41 株，其中戊糖片球菌10 株（24.39%）、發(fā)酵乳桿菌7 株（17.07%）、短乳桿菌6株（14.63%）、瑞士乳桿菌4 株（9.76%）、干酪乳桿菌2 株（4.88%）、面包乳桿菌2 株（4.88%）、淀粉乳桿菌2 株（4.88%）、耐久腸球菌2 株（4.88%）、植物乳桿菌1 株（2.44%）、凝結(jié)芽孢桿菌1 株（2.44%）、乳酸乳球菌1 株 （2.44%）、乳酸片球菌1 株（2.44%）、粘膜乳桿菌1 株（2.44%）、鼠李糖乳桿菌1 株（2.44%）。泡菜中共分離出乳酸菌21 株，其中主要是植物乳桿菌，分離出15 株（71.43%），另外還有5 株短乳桿菌（23.81%）和1 株戊糖片球菌（4.76%）。傳統(tǒng)乳制品中共分離出35 株乳酸菌，其中植物乳桿菌11 株（31.34%）、凝結(jié)芽孢桿菌16株（45.71%）、戊糖片球菌1 株（2.86%）、耐久腸球菌7 株（20%）。

2.2 乳酸菌菌株的抗生素耐藥性評(píng)估

如表2和圖3所示，乳酸菌對(duì)萬古霉素、慶大霉素、卡那霉素、鏈霉素、四環(huán)素和替考拉寧的耐藥性較強(qiáng)，耐藥率達(dá)50%以上；對(duì)氨芐青霉素、紅霉素、甲氧芐啶、頭孢呋肟較敏感，耐藥率為10%左右。1995年，Elisha 等[10]研究了不同種乳桿菌的耐藥性，發(fā)現(xiàn)菌體中存在D-丙氨酸和D-丙氨酸連接酶，導(dǎo)致其對(duì)萬古霉素形成天然耐藥性。隨后，其他學(xué)者也報(bào)道在鼠李糖乳桿菌、植物乳桿菌、乳酸乳球菌以及明串珠菌等也存在對(duì)萬古霉素的天然耐藥性，并證實(shí)其耐藥耐性由位于染色體基因組上的vnaX 基因編碼[11]。秦宇軒等[12]對(duì)分離自市售酸奶中的100 株乳酸菌進(jìn)行耐藥性檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)100%的菌株對(duì)鏈霉素和慶大霉素耐藥，部分對(duì)萬古霉素耐藥。張灼陽等[13]、Danielsen 等[14]的研究也表明大部分乳酸菌對(duì)于慶大霉素、鏈霉素、卡那霉素、替考拉寧、萬古霉素等抗生素具有耐藥性。董銀萍等[15]對(duì)北京市售酸奶中分離得到的乳酸菌菌株進(jìn)行耐藥性研究，發(fā)現(xiàn)所有菌株對(duì)青霉素、氨芐青霉素敏感。Comunian 等[16]對(duì)121 株來自意大利發(fā)酵產(chǎn)品中的乳酸菌的研究表明，94.2%的菌株對(duì)紅霉素敏感，77.7%的菌株對(duì)四環(huán)素敏感。潘露[6]對(duì)來自11 種發(fā)酵食品中的乳酸菌進(jìn)行耐藥分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)對(duì)環(huán)丙沙星和克林霉素耐藥的乳酸菌株最多（85.71%），其次是氨芐青霉素、氯霉素、紅霉素（64.28%）?？梢姡樗峋甑哪退幊潭扰c食品來源、種類、加工環(huán)境及加工方法密切相關(guān)。

研究結(jié)果顯示植物乳桿菌和耐久腸球菌的耐藥性最強(qiáng)，對(duì)各種抗生素都具有不同程度的耐藥性。85%以上的植物乳桿菌對(duì)萬古霉素、慶大霉素、卡那霉素、鏈霉素和替拉考寧具有耐藥性，并且對(duì)四環(huán)素（59.26%）、氯霉素（74.07%）、克林霉素（37.04%）和利福平（44.40%）的耐藥性也較強(qiáng)，對(duì)氨芐青霉素、紅霉素、甲氧芐啶和頭孢呋肟較為敏感，耐藥率均為7.41%。有報(bào)道[17]稱乳酸桿菌通常對(duì)青霉素類抗生素 （氨芐青霉素和哌拉西林）和β-內(nèi)酰胺酶抑制劑表現(xiàn)為敏感，這些抗生素通常用來抑制細(xì)胞壁合成，對(duì)抑制蛋白質(zhì)合成的抗生素顯示為敏感，如紅霉素和克林霉素等，然而對(duì)氨基糖苷類（卡那霉素、鏈霉素和慶大霉素等），大部分乳酸桿菌對(duì)其顯示為耐藥。一般情況下，大部分乳酸桿菌對(duì)抑制核酸合成的抗生素耐藥，如甲氧芐啶等為固有耐藥，而本研究中的植物乳桿菌卻對(duì)甲氧芐啶顯示出高度敏感 （92.59%）。Lavilla-Lerma 等[18]對(duì)分離自西班牙農(nóng)家山羊奶酪中的植物乳桿菌進(jìn)行耐藥性檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)所有菌株對(duì)環(huán)丙沙星、萬古霉素和替考拉寧耐藥，30%左右的菌株對(duì)青霉素、四環(huán)素、利福平、左氧氟沙星耐藥，90%以上的菌株對(duì)氨芐西林、慶大霉素、鏈霉素、紅霉素和氯霉素敏感。進(jìn)一步證實(shí)了乳酸菌耐藥的復(fù)雜機(jī)制。

圖2 基于16S rDNA 序列的典型分離乳酸菌菌株系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Dendrogram of LAB isolates based on 16S rDNA sequence

平福利4 4.40）（12 16.67）（2 9.09）（1 23.53）（4 55.56）（5 0.00（0）0.00）（0 0.00）（0 0.00）（0 0.00（0）0.00）（0 0.00）（0 0.00）（0 0.00）（0 24.74）（24孢頭丙環(huán)肟呋星沙7.41 77.78）（2）（21 0.00 8.33）（0）（1 0.00 0.00）（0）（0 0.00 5.88）（0）（1 44.44 33.33）（4）（3 0.00 0.00（0）（0）0.00 0.00）（0）（0 0.00 0.00）（0）（0 0.00 0.00）（0）（0 0.00 50.00（0）（1）0.00 0.00）（0）（0 0.00 0.00）（0）（0 0.00 0.00）（0）（0 0.00 0.00）（0）（0 6.19 27.84）（6）（27（n=97）型表藥耐的株菌菌酸乳2 表Prevalence and distribution of antibiotic resistant phenotype among LAB isolates （n=97）Table 2 ） （n /%型表藥耐林克考替氧甲那卡大慶古萬素霉氯素環(huán)四 素霉青 素霉紅 素霉鏈素霉寧拉啶芐素霉素霉素霉37.04 74.07 96.30 7.41 59.26 18.52 7.41 92.59 85.19 88.89 96.30）（10）（20）（26）（2）（16）（5）（2）（25）（23）（24）（26 58.33 25.00 16.67 0.00 33.33 0.00 0.00 41.67 33.33 41.67 16.67）（7）（3）（2）（0）（4）（0）（0）（5）（4）（5）（2 18.18 18.18 27.27 0.00 0.00 0.00 0.00 27.27 45.45 36.36 27.27）（2）（2）（3）（0）（0）（0）（0）（3）（5）（4）（3 5.88 17.65 41.18 17.65 47.06 11.76 17.65 88.24 76.47 64.71 70.59）（1）（3）（7）（3）（8）（2）（3）（15）（13）（11）（12 22.22 55.56 88.89 11.11 66.67 66.67 33.33 100.00 100.00 100.00 100.00 ）（2）（5）（8）（1）（6）（6）（3）（9）（9）（9）（9 14.29 14.29 28.57 0.00 14.29 0.00 0.00 28.57 28.57 28.57 28.57（1）（1）（2）（0）（1）（0）（0）（2）（2）（2）（2）0.00 0.00 0.00 0.00 25.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00）（0）（0）（0）（0）（1）（0）（0）（0）（0）（0）（0 0.00 0.00 0.00 0.00 100.00 0.00 0.00 100.00 100.00 100.00 100.00 ）（0）（0）（0）（0）（2）（0）（0）（2）（2）（2）（2 0.00 0.00 0.00 0.00 100.00 0.00 100.00 100.00 100.00 100.00 100.00 ）（0）（0）（0）（0）（2）（0）（2）（2）（2）（2）（2 0.00 50.00 50.00 0.00 100.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00（0）（1）（1）（0）（2）（0）（0）（0）（0）（0）（0）0.00 0.00 0.00 0.00 100.00 0.00 0.00 100.00 100.00 100.00 100.00 ）（0）（0）（0）（0）（1）（0）（0）（1）（1）（1）（1 0.00 0.00 0.00 0.00 100.00 0.00 0.00 100.00 100.00 100.00 100.00 ）（0）（0）（0）（0）（1）（0）（0）（1）（1）（1）（1 0.00 0.00 0.00 0.00 100.00 0.00 0.00 100.00 100.00 100.00 100.00 ）（0）（0）（0）（0）（1）（0）（0）（1）（1）（1）（1 0.00 0.00 0.00 0.00 100.00 0.00 0.00 100.00 100.00 100.00 100.00 ）（0）（0）（0）（0）（1）（0）（0）（1）（1）（1）（1 23.71 36.08 50.52 6.19 47.42 13.40 10.31 69.07 65.98 64.95 61.86）（23）（35）（49）（6）（46）（13）（10）（67）（64）（63）（60芐氨素霉青7.41）（2 8.33）（1 18.18）（2 17.65）（3 33.33）（3 0.00（0）0.00）（0 0.00）（0 0.00）（0 0.00（0）0.00）（0 0.00）（0 0.00）（0 0.00）（0 11.34）（11）（n種菌）（27菌桿乳）（12菌球片（11）菌桿） （17菌桿孢芽）（9菌球腸）（7菌桿乳）（4菌桿乳）（2菌桿乳）（2菌桿乳（2）菌桿乳）（1菌球乳）（1菌桿乳）（1菌球片（1）菌桿乳糖）（97物植糖戊乳短結(jié)凝久耐酵發(fā)士瑞酪干包面粉淀酸乳膜粘酸乳李鼠計(jì)總

圖3 乳酸菌分離菌株的耐藥表型分布?xì)馀輬D（氣泡大小反映檢出率高低）（n=97）Fig.3 Bubble chart of antibiotic resistant phenotype among LAB isolates （n=97）

腸球菌屬作為獲得性耐藥的典型菌屬代表，近年來倍受關(guān)注，尤其是有關(guān)其耐藥基因的攜帶、轉(zhuǎn)移、突變等耐藥機(jī)制。研究結(jié)果顯示100%的耐久腸球菌對(duì)萬古霉素、慶大霉素、卡那霉素、鏈霉素具有耐藥性，另外對(duì)青霉素（66.67%）、四環(huán)素（66.67%）、替拉考寧（88.89%）、氯霉素（55.56%）、利福平（55.56%） 的耐藥性也較強(qiáng)。對(duì)甲氧芐啶（11.11%）和克林霉素（22.22%）較為敏感。王夢(mèng)姣[19]對(duì)分離自內(nèi)蒙古牧區(qū)馬奶及其制品中的腸球菌屬乳酸菌進(jìn)行耐藥性試驗(yàn)，結(jié)果表明100%的菌株對(duì)紅霉素、氨芐西林、阿莫西林敏感，86%以上的菌株對(duì)氧氟沙星、諾氟沙星、環(huán)丙沙星等喹諾酮類藥物敏感。Erbas 等[20]對(duì)來源于奶牛乳腺炎乳樣中的94 株腸球菌進(jìn)行了耐藥表型測(cè)定，發(fā)現(xiàn)其耐藥率分別為四環(huán)素81.9%、紅霉素28.7%、氯霉素10.7%、萬古霉素1.06%。

從食品中分離出的片球菌屬的藥物敏感性數(shù)據(jù)很少。本試驗(yàn)所分離的12 株戊糖片球菌的所有菌株對(duì)紅霉素、青霉素、甲氧芐啶和頭孢呋肟敏感，對(duì)環(huán)丙沙星8.33%、氨芐青霉素8.33%、利福平16.67%也較為敏感，有報(bào)道證實(shí)此研究結(jié)果。一般來說，片球菌對(duì)青霉素、紅霉素、亞胺培南、氯霉素、利福平等抗生素的藥敏結(jié)果表明為敏感。本試驗(yàn)中的戊糖片球菌對(duì)克林霉素（58.33%）、慶大霉素（41.67%）、鏈霉素（41.67%）、四環(huán)素（33.33%）和卡那霉素（33.33%）的耐藥性較強(qiáng)。Swenson 等[21]也曾報(bào)道片球菌屬對(duì)糖肽類四環(huán)素、萬古霉素、環(huán)丙沙星、替考拉寧、復(fù)方新諾明等顯示為固有耐藥。而本文中僅有2 株片球菌對(duì)環(huán)丙沙星替考拉寧和萬古霉素具有耐藥性。11 株短乳桿菌對(duì)紅霉素、青霉素、四環(huán)素、甲氧芐啶、環(huán)丙沙星和頭孢呋肟敏感，對(duì)慶大霉素、卡那霉素耐藥，耐藥率分別為36.36%和45.45%。60%以上的凝結(jié)芽孢桿菌對(duì)萬古霉素、慶大霉素、卡那霉素和鏈霉素呈耐藥性，對(duì)四環(huán)素（47.06%）和替考拉寧（41.18%）的耐藥性也較強(qiáng)，而對(duì)其它類抗生素的耐藥性較弱（0～23.53%）。另外，還有2 株干酪乳桿菌、2 株面包乳桿菌、1 株乳酸乳球菌、1 株粘膜乳桿菌、1 株乳酸片球菌和1 株鼠李糖乳桿菌對(duì)萬古霉素、慶大霉素、卡那霉素、四環(huán)素和鏈霉素呈現(xiàn)出100%的耐藥性，而對(duì)其它類抗生素均敏感。2 株淀粉乳桿菌呈現(xiàn)出50%的替考拉寧、氯霉素環(huán)丙沙星耐藥性和100%的四環(huán)素耐藥性。

2.3 乳酸菌菌株的耐藥基因分布情況

為初步探究乳酸菌的耐藥機(jī)制，實(shí)驗(yàn)人員檢測(cè)了大環(huán)內(nèi)酯-林肯酰胺類ML（ermA，ermB，msrA/B，lnuA）及四環(huán)素類（tetM，tetK）、氨基糖苷類（aac（6′）-aph（2″），aph（3’）-III，strA，strB）、β-內(nèi)酰胺類（blaZ）、氯霉素（cat）和萬古霉素（vanX）等抗生素耐性基因在97 株乳酸菌中的分布情況。

試驗(yàn)結(jié)果顯示攜帶最多的ML 耐藥基因是ermB （86.60%），其次是lnuA （45.36%），ermC（36.08%）和msrA/B（22.22%）。菌株對(duì)大環(huán)內(nèi)酯-林肯酰胺類（ML）的耐藥機(jī)制主要有3 種[22]：1）erm基因編碼的核糖體甲基化修飾酶，對(duì)23S rRNA核糖體的修飾、突變作用，改變了大環(huán)內(nèi)酯類抗生素（如紅霉素）與抗生素的結(jié)合位點(diǎn)；2）由msr 基因編碼抗生素溢流泵系統(tǒng)，屬于ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)子，主要負(fù)責(zé)誘導(dǎo)對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素及鏈霉殺陽菌素的抗性；3）lnuA 編碼的林肯（酰）胺核甙酸基轉(zhuǎn)移酶，Loeza-Lara 等[23]于2004年從隱性乳腺炎乳樣中分離的金黃色葡萄球菌中檢出該基因。

四環(huán)素能封閉核糖體30 S 亞基上的A 部位，使氨酰-tRNA 的反密碼子不能與mRNA 結(jié)合，從而阻斷肽鏈延伸。乳酸菌中常見的四環(huán)素抗性基因有核糖體保護(hù)蛋白tet（M）、tet（W），四環(huán)素外排蛋白tet（K）、tet（L）。本文中tetM 和tetK 的檢出率分別為91.75%和39.18%。Ouoba 等[24]和董春陽[25]也發(fā)現(xiàn)了tetM 在乳酸菌中的高檢出率（75%以上）現(xiàn)象。Huys 等[26]、楊埔[27]和Mannu 等[28]也曾分別證明tetM 基因位于糞腸球菌的質(zhì)粒pM7M2 和轉(zhuǎn)座子家族Tn9162 和Tn1545 上，可以在不同的微生物間轉(zhuǎn)移，對(duì)人類健康有潛在威脅。

氨基糖苷類抗生素產(chǎn)生作用的主要靶點(diǎn)是核糖體，16S rRNA 的突變、甲基化修飾等，使抗生素與之結(jié)合的親和力降低，產(chǎn)生耐藥性等。本文氨基糖苷類耐藥基因中，攜帶率最高的為aac（6′）-aph（2″）（53.61%），最低的為aph（3′）-III 基因（7.22%），與周寧[29]報(bào)道的市售酸奶中分離的保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌種16.3%的aph（3′）-III 基因攜帶率相似。2008年，Ouoba 等[24]從乳酸菌中檢測(cè)出編碼卡那霉素的耐藥基因aph （3′）-III，之后Paula等[30]進(jìn)一步證實(shí)了aph（3′）-III 存在于質(zhì)粒上，指出其可以轉(zhuǎn)移到其它致病菌的可能性。本文中編碼鏈霉素的耐藥基因strA（34.02%）和strB（27.84%）的攜帶率高于周寧[29]的報(bào)道（strA，20.51%和strB，15.38%），遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于耐藥表型的檢出率（69.07%），可能存在其它耐藥基因（如：aadE 等）及耐藥機(jī)制（外排、生物被膜等）。

β-內(nèi)酰胺類抗生素包括臨床最常用的青霉素與頭孢菌素等。blaZ 編碼β-內(nèi)酰胺酶，可水解青霉素的β-內(nèi)酰胺環(huán)，使藥物失去作用。本試驗(yàn)中blaZ 的檢出率為32.99%，其中在干酪乳桿菌、淀粉乳桿菌、乳酸乳桿菌的檢出率都為100%，而耐藥表型卻對(duì)氨芐青霉素、青霉素和頭孢呋肟敏感?？赡苡捎诨虻哪硞€(gè)位點(diǎn)發(fā)生突變導(dǎo)致的“基因沉默”現(xiàn)象，可見耐藥分子機(jī)制的復(fù)雜性需進(jìn)一步研究。

乳酸桿菌對(duì)萬古霉素為固有耐藥，耐藥基因vanX 由染色體編碼，無轉(zhuǎn)移特性。主要是肽聚糖骨架中NAM-肽和NAG-肽末端的氨基酸殘基發(fā)生改變，變成D-丙氨酰乳酸，使萬古霉素與末端的親和力下降1 000 倍。本文的試驗(yàn)結(jié)果與謝麗斯等[31]對(duì)來自于傳統(tǒng)發(fā)酵食品酸奶和泡菜中的53株乳酸菌檢測(cè)結(jié)果相似，即耐藥表型的檢出率都很高，分別為61.86%和100%，而基因的檢出率卻為0。

乳酸菌中最常見的氯霉素抗性基因是乙酰轉(zhuǎn)移酶基因（cat）。與萬古霉素類似，試驗(yàn)中cat 基因的檢出率為0，表型檢測(cè)顯示其具有36.08%的耐藥性，楊埔[27]證實(shí)了此類現(xiàn)象。說明這些菌株的氯霉素抗性不是由cat 基因引起的，可能存在一些藥物外排系統(tǒng)。對(duì)E.faecalis V583 的氯霉素應(yīng)激性反應(yīng)的研究表明，加入氯霉素后，一些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)上調(diào)，可能將氯霉素排出細(xì)胞外，而脂肪酸代謝的基因表達(dá)上調(diào)，則使細(xì)胞膜發(fā)生改變，可能阻止氯霉素的進(jìn)入。這些研究表明，乳酸菌對(duì)氯霉素的應(yīng)激反應(yīng)是一個(gè)復(fù)雜的過程，有待深入研究。另外，自發(fā)突變也會(huì)導(dǎo)致抗性的產(chǎn)生。

aph（3’）-III vanX strB 17.86 0.00 35.71）（5）（0）（10 0.00 0.00 0.00（0）（0）（0）0.000 0.00 45.45）（0）（0）（5 0.00 0.00 0.00）（0）（0）（0 22.22 0.00 55.56）（2）（0）（5 0.00 0.00 42.86）（0）（0）（3 0.00 0.00 0.00）（0）（0）（0 0.00 0.00 100）（0）（0）（2 0.00 0.00 100（0）（0）（2）0.00 0.00 0.00）（0）（0）（0 0.00 0.00 0.00）（0）（0）（0 0.00 0.00 0.00）（0）（0）（0 0.00 0.00 0.00（0）（0）（0）0.00 0.00 0.00）（0）（0）（0 7.22 0.00 27.84）（7）（0）（27布分的中株菌菌酸乳在因基藥耐 3表Prevalence and distribution of antibiotic resistance genes among LAB isolates Table 3 ）（n /%因基藥耐）（6′aac strA blaZ cat lnuA tetK tetM ermC ermB）（2″-aph 42.86 51.85 0.00 74.07 37.04 37.04 96.30 40.74 96.30）（12）（14）（0）（20）（10）（10）（26）（11）（26 0.00 50.00 0.00 75.00 50.00 33.33 91.67 41.67 83.33（0）（6）（0）（9）（6）（4）（11）（5）（10）54.55 27.27 0.00 90.91 55.56 27.27 90.91 45.45 100.00）（6）（3）（0）（10）（5）（3）（10）（5）（11 0.00 0.00 0.00 11.76 23.53 11.76 70.59 23.53 58.82）（0）（0）（0）（2）（10）（2）（12）（4）（10 55.56 0.00 0.00 22.22 66.67 88.89 100.00 66.67 100.00）（5）（0）（0）（2）（6）（8）（9）（6）（9 57.14 42.86 0.00 28.57 28.57 71.43 100.00 28.57 100.00）（4）（3）（0）（2）（2）（5）（7）（2）（7 0.00 25.00 0.00 50.00 25.00 100.00 100.00 25.00 100.00）（0）（1）（0）（2）（1）（4）（4）（1）（4 100 100.00 0.00 100.00 100.00 100.00 100.00 0.00 100.00）（2）（2）（0）（2）（2）（2）（2）（0）（2 100 0.00 0.00 100.00 50.00 0.00 100.00 0.00 100.00（2）（0）（0）（2）（1）（0）（2）（0）（2）100 100.00 0.00 50.00 50.00 0.00 100.00 0.00 100.00）（2）（2）（0）（1）（1）（0）（2）（0）（2 0.00 100.00 0.00 0.00 0.00 0.00 100.00 100.00 0.00）（0）（1）（0）（0）（0）（0）（1）（1）（0 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 100.00 0.00 0.00）（0）（0）（0）（0）（0）（0）（1）（0）（0 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 100.00 0.00 100.00（0）（0）（0）（0）（0）（0）（1）（0）（1）0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 100.00 0.00 0.00）（0）（0）（0）（0）（0）（0）（1）（0）（0 34.02 32.99 0.00 53.61 45.36 39.18 91.75 36.08 86.60）（33）（32）（0）（52）（44）（38）（89）（35）（84 msrA/B 0.00）（0 0.00（0）0.00）（0 0.00）（0 22.22）（2 0.00）（0 0.00）（0 0.00）（0 0.00（0）0.00）（0 0.00）（0 0.00）（0 0.00（0）0.00）（0 22.22）（2（n）種菌）（28菌桿乳（12）菌球片）（11菌桿）（17菌桿孢芽）（9菌球腸（7）菌桿乳）（4菌桿乳）（2菌桿乳）（2菌桿乳）（2菌桿乳）（1菌球乳）（1菌桿乳（1）菌球片）（1菌桿乳糖）（97物植糖戊乳短結(jié)凝久耐酵發(fā)士瑞酪干包面粉淀酸乳膜粘酸乳李鼠計(jì)總

圖4 乳酸菌分離菌株的耐藥基因分布?xì)馀輬D（氣泡大小反映檢出率高低）（n=97）Fig.4 Bubble chart of antibiotic resistance genes among LAB isolates （n=97）

圖5 多重耐藥乳酸菌菌株在醋醅（n=41），泡菜（n=21）和乳制品（n=35）中的分布Fig.5 Distribution of multidrug resistant LAB isolates in brewing mass （n=41），pickle （n=21） and dairy products （n=35）

本試驗(yàn)中共檢測(cè)出耐藥表型≥6 的多重耐藥菌株48 株，其中醋醅中5 株、泡菜中15 株、乳制品中28 株，多重耐藥菌株分離率分別為（5/41，12.20%），（15/21，71.43%），（28/35，80.00%）。耐藥基因型≥5 的多重耐藥菌株57 株，其中醋醅中16株、泡菜中16 株、乳制品中25 株，多重耐藥菌株分離率分別為（16/41，39.02%），（16/21，76.19%），（25/35，71.43%）。并且多重耐藥菌株主要分布在植物乳桿菌（22/48，45.83%；24/57，42.11%）、凝結(jié)芽孢桿菌（10/48，20.83%；4/57，7.02%）、耐久腸球菌（7/48，14.58%；7/57，12.28%）和短乳桿菌（4/48，8.33%；6/57，10.53%）中。

2.4 乳酸菌菌株的生物被膜形成能力與耐藥性之間的關(guān)系

生物被膜的產(chǎn)生使膜內(nèi)菌對(duì)抗生素的耐藥性比浮游菌增加10～1 000 倍，菌體一旦形成生物膜，即可表現(xiàn)出很高的耐藥性，其機(jī)制[32]主要為：1）抗生素滲透障礙，一般的抗生素難以穿透生物被膜，它帶有大量的陰離子而能通過氫鍵、共價(jià)鍵、范德華力吸附帶有陽離子的抗菌藥物，它還帶有許多鈍化酶、水解酶、過氧化氫酶而能滅活部分抗菌藥物；2）生物膜內(nèi)細(xì)菌代謝的毒素難以釋放，氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)少，惡劣的環(huán)境使細(xì)菌代謝緩慢，對(duì)抗生素的敏感性降低；3） 生物膜內(nèi)細(xì)菌特殊的基因表達(dá)方式，可使耐藥基因表達(dá)增加。

為探討生物被膜產(chǎn)生能力與菌株耐藥性之間的關(guān)系，測(cè)定了97 株乳酸菌產(chǎn)生物被膜的能力，如圖6所示，MTP 定量測(cè)定方法將菌株產(chǎn)生物被膜的能力分為強(qiáng)（18 株）、適中（27 株）、較弱（17株）、不產(chǎn)（35 株）4 個(gè)等級(jí)，共有62 株菌的測(cè)定結(jié)果為陽性。圖7顯示產(chǎn)生物被膜和不產(chǎn)生物被膜菌株間的多重耐藥性的比較情況，相比不產(chǎn)生物被膜的菌（Res≥6 和Res≥10 的菌株數(shù)分別為12和0），產(chǎn)生物被膜的菌株呈現(xiàn)出更強(qiáng)的多重耐藥性 （Res≥6 和Res≥10 的菌株數(shù)分別為36 和12）。謝麗斯等[31]通過研究發(fā)酵食品中乳酸菌的生物被膜介導(dǎo)耐藥研究中也得到相似的結(jié)論，證明32 株乳酸菌具有不同的生物成膜能力，且成膜后的乳酸菌抗生素耐藥性增強(qiáng)。生物被膜的形成過程、機(jī)理非常復(fù)雜，由眾多基因調(diào)控。為有效預(yù)防、解決所面臨的公共食品安全問題，今后不僅要對(duì)食品中分離菌株的耐藥基因進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控，還要對(duì)生物被膜的表型、基因型及其調(diào)控機(jī)制進(jìn)行深入研究。

圖6 97 株乳酸菌生物被膜形成能力Fig.6 The ability of biofilm production among 97 LAB isolates

圖7 產(chǎn)生物被膜和不產(chǎn)生物被膜乳酸菌菌株間的多重耐藥性的比較Fig.7 Multiple drug resistance among MTP + and MTP- LAB strains

3 結(jié)論

本文對(duì)我國傳統(tǒng)發(fā)酵食品，主要分析研究了醋醅、泡菜和發(fā)酵乳制品中乳酸菌的耐藥表型和基因型。結(jié)果表明，所分離的97 株乳酸菌對(duì)所有測(cè)試抗生素均呈不同程度的耐藥性，其中對(duì)萬古霉素、慶大霉素、卡那霉素、鏈霉素、四環(huán)素和替考拉寧的耐藥性較強(qiáng)。攜帶最多的耐藥基因是tetM（91.75%）和ermB（86.60%）基因，其次為aac（6′）-aph（2″）（53.61%），lnuA（45.36%），tetK（39.18%），ermC（36.08%），strA（34.02%）和blaZ（32.99%）基因。具有產(chǎn)生物被膜能力的菌株的多重耐藥性顯著高于不產(chǎn)生物被膜的菌株。研究顯示，傳統(tǒng)發(fā)酵食品中菌株的耐藥性已成為食品安全的重要隱患，今后需加強(qiáng)耐藥檢測(cè)、追溯、監(jiān)督、管理和控制。